As plaquetas devem estar livres de células sanguíneas e proteínas ao estudar suas propriedades bioquímicas e fisiológicas. Por isso, desenvolvemos um protocolo para purificar plaquetas do sangue do rato. Esta técnica pode purificar plaquetas usando centrífugo de gradiente iohexol de média e baixa velocidade, resultando em uma clara separação de plaquetas de outros componentes sanguíneos.
Para purificar as plaquetas, use uma ponta de pipeta larga para a camada 200 microliters de sangue inteiro recém-colhido lentamente ao lado de um tubo de 1,5 mililitro em 600 microliters de meio gradiente iohexol sem misturar. Após a centrifugação em um rotor de balde balançando para isolar as plaquetas, use uma nova ponta de pipeta larga para coletar a maior parte da camada rica em plaquetas e uma pequena fração da camada pobre plaqueta sem aspirar a célula sanguínea branca ou a camada de glóbulos vermelhos. Adicione a amostra plaqueta a um novo tubo e adicione um mililitro de PBS às plaquetas.
Misture as plaquetas por inversão antes de realizar outra centrifugação. Em seguida, resuspenja a pelota em 200 microliters de PBS com tubulação leve. Para ativação plaquetária, transfira de uma a duas vezes 10 para as seis plaquetas para um novo tubo contendo 100 microliters de tampão de coloração.
Adicione uma a duas vezes 10 às seis plaquetas a um tubo diferente contendo 100 microliters de tampão de coloração complementados com peptídeo GPRP de 0,4 mililitro. Adicione trombina ao tubo com o peptídeo GPRP para ativar as plaquetas e adicione o coquetel de anticorpos de interesse a ambos os tubos. Como um controle positivo, adicione um microliter de sangue inteiro em até 100 microliters de tampão de coloração em um tubo contendo peptídeo GPRP de 0,4 milimiliar, e adicione trombina para ativar essas plaquetas.
Como controle negativo, adicione um microliter de sangue inteiro em até 100 microliters de tampão de coloração. Em seguida, manche ambos os tubos de controle com o coquetel de anticorpos. Após 30 minutos em temperatura ambiente no escuro, lave as amostras com um mililitro de tampão de coloração fresco por tubo.
Resuspenja as pelotas em 300 microliters de tampão de coloração fresco. Em seguida, transfira as amostras de células para tubos individuais de análise de citometria de fluxo protegidos da luz. Para analisar as plaquetas por citometria de fluxo, crie um novo experimento e gere dispersão logarítmica para frente versus parcelas de pontos de dispersão lateral logarítmica.
Depois de ajustar as tensões conforme necessário, registo as células manchadas de cor única para os controles de compensação. Agora execute a amostra de controle positivo para adquirir células suficientes para ajustar a compensação e os portões. Em seguida, adquira e registe 100.000 eventos para cada amostra de sangue inteira, e analise os dados de citometria de fluxo usando as parcelas e portões apropriados.
Se o sangue for adicionado ao meio lentamente, o meio gradiente iohexol e a amostra de sangue formarão duas camadas separadas no tubo. Após a centrifugação, a camada superior, cor de palha, contém o plasma, mas sem células sanguíneas intactas. A segunda camada, esbranquiçada e rica em plaquetas contém a maioria das plaquetas.
A terceira camada transparente é a camada pobre em plaquetas e está diretamente acima dos glóbulos vermelhos e da pelota de glóbulos brancos. O sangue inteiro exibe populações distintas de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas em uma dispersão logarítmica para frente versus parcela de pontos de dispersão lateral. As plaquetas purificadas, no entanto, demonstram uma população distinta com um número insignificante de glóbulos vermelhos ou brancos.
Amostras de sangue inteiro contêm glóbulos vermelhos ter119 positivos e populações de glóbulos brancos cd45 positivos que estão quase ausentes em amostras de plaquetas purificadas. Plaquetas purificadas não tratadas expressam quase nenhum marcador de ativação confirmando seu estado de descanso, enquanto plaquetas tratadas com trombina purificadas normalmente demonstram uma expressão de 71% P-selectin. A avaliação microscópica de amostras de plaquetas purificadas não tratadas não revela nenhuma agregação plaqueta.
Após a ativação com trombina, no entanto, as plaquetas demonstram uma agregação robusta, confirmando ainda mais sua viabilidade após a purificação como demonstrado. Coloque a amostra de sangue cuidadosamente no meio do iohexol, e ao coletar as plaquetas, certifique-se de aspirar cuidadosamente para não coletar as camadas de glóbulos vermelhos e de glóbulos brancos para uma purificação de plaquetas bem sucedida. Este método também pode ser usado para purificação de plaquetas de outras espécies.
As plaquetas purificadas podem ser usadas para estudos de expressão genética, ativação, agregação, liberação de grânulos e adesão.
