Borrelia è un genere di batteri della spirocheta che comprende tre tipi principali. Il gruppo Borreliosi di Lyme, il gruppo della febbre recidivante e il gruppo meno ben caratterizzato trovato nei rettili. Molte specie di Borrelia sono patogene.
La coltura di batteri è il gold standard per la rilevazione dell'infezione. Questo è vero sia per la ricerca che per il lavoro clinico. La coltura di batteri dal fluido corporeo e dai tessuti conferma che i batteri sono sia vitali che replicanti.
Questo protocollo dimostra la metodologia e le ricette necessarie per coltivare e preservare con successo il gruppo di spirochete della borreliosi di Lyme, la febbre recidivante Borrelia e la Borrelia miyamotoi. Sono previsti metodi per la coltura di specie e ceppi precedentemente isolati, nonché nuovi isolati e isolati monoclonali da fonti ambientali o di mammiferi. A dimostrare la procedura saranno Marie-Line Faucillion, ricercatrice post-dottorato, e Ingela Nilsson, tecnico del Bergstrom Lab, Anne Berthold, ricercatrice associata del Lloyd Lab, e Maryna Golovchenko, ricercatrice associata del Rudenko Lab.
Per iniziare, procurati i reagenti necessari per preparare un litro di terreno Barbara-Stoner-Kelly o BSK-II. Inizia sciogliendo la BSA in un becher mescolando l'acqua. Quindi aggiungere tutti i prodotti chimici secchi e lasciarli sciogliere prima di aggiungere CMRL.
Regolare il pH del mezzo a 7,6. Se necessario, utilizzare un idrossido di sodio molare. Quindi, aggiungere siero di coniglio al mezzo a una concentrazione dal sei al 10%Se la crescita batterica non è forte, aggiungere un altro al 2% di siero al substrato.
Quindi sterilizzare il mezzo utilizzando un filtro a pori da 0,22 micron. Congelare lo stock di mezzo in aliquote da 100 o 400 millilitri. Per i ceppi di febbre recidivante, aggiungere 100 millilitri di gelatina sterile al 7% a 400 millilitri di terreno BSK-II.
Disinfettare la superficie e tutti i materiali con etanolo al 7% e trasferirli immediatamente nell'armadio di sicurezza biologica. Sterilizzare UV tutti i materiali non biologici per cinque minuti prima dell'inizio del lavoro. Per iniziare una cultura, pre-riscaldare il mezzo in un'incubatrice.
Quindi aggiungere un millilitro di coltura Borrelia scongelata da uno stock di glicerolo a cinque a 15 millilitri di mezzo BSK preriscaldato. Riempire i tubi quasi completamente per creare un'atmosfera micro o anaerobica prima di chiuderli. Crescono specie di febbre recidivante a 37 gradi Celsius e specie di Borrelia burgdorferi sensu lato a 33-34 gradi Celsius.
Monitorare la crescita della coltura Borrelia utilizzando il contrasto di fase o la microscopia in campo oscuro da 200 a 400 volte l'ingrandimento. Per garantire la distribuzione uniforme delle cellule, mescolare la coltura con una pipetta sierologica o utilizzare una pipetta di trasferimento da tre millilitri durante il pipettaggio su e giù. Quindi caricare su un'aliquota di coltura da 10 microlitri su ciascun lato di un emocitometro per il conteggio.
Quindi, diluire la coltura di Borrelia in fase esponenziale in un rapporto di uno a due o uno a quattro con un mezzo in un tubo da 1,7 millilitri. Quando si determina la conta cellulare, considerare il fattore di diluizione in modo appropriato. Dopo l'uso, spruzzare le superfici e l'emocitometro con candeggina diluita al 10% e/o etanolo al 70%.
Per l'estrazione del DNA o l'isolamento delle cellule Borrelia, centrifugare la coltura in fase esponenziale per 10 minuti a 4.000 G e gettare il surnatante in un rifiuto a rischio biologico adatto. Elaborare i batteri pellettati con un kit di estrazione del DNA commerciale o risospenderli in un mezzo appropriato per l'esperimento previsto. Alla fine di ogni esperimento, sterilizzare tutte le apparecchiature con etanolo e radiazioni UV.
Raccogliere i rifiuti liquidi, compresa la coltura in eccesso, in una bottiglia di rifiuti e aggiungere il 10% di candeggina. Posizionare il flacone a 80 gradi Celsius prima di scartarlo. Per la conservazione a lungo termine delle colture di Borrelia, prendere il volume desiderato di una coltura in fase esponenziale da 10 milioni a 100 milioni di cellule per millilitro, aggiungere il 10% di glicerolo sterile e mescolare pipettando su e giù.
Trasferire aliquote da 1,5 millilitri della miscela in flaconcini criogenici con tappo a vite da due millilitri. Conservare i flaconcini a 80 gradi Celsius. Mantenere una scorta con almeno 10 tubi di ogni ceppo nel congelatore, Per coltivare Borrelia dalle zecche dure, raccogliere femmine adulte, maschi e zecche ninfali.
La superficie sterilizza le zecche immergendole in etanolo al 70% per due minuti e asciugandole all'aria in un armadio di biosicurezza. Quindi, sezionare le zecche individualmente in più pezzi usando un bisturi sterile. Quindi posizionare i pezzi in un tubo da due millilitri contenente 1,5 millilitri del mezzo integrato con antibiotici.
Incubare le colture a 34 gradi Celsius e verificare la presenza di spirochete mediante microscopia a contrasto in campo scuro o fase due volte alla settimana per le prime due settimane e successivamente settimanalmente per sei settimane. Per coltivare Borrelia da campioni di sangue, rimuovere delicatamente il plasma dal tubo e inoculare un millilitro di plasma in cinque millilitri di terreno preriscaldato, modificato Kelly-Pettenkofer o MKP Complete. Per la coltivazione di Borrelia da una biopsia cutanea, sterilizzare la superficie della biopsia cutanea con etanolo al 70% e perossido di idrogeno.
Quindi posizionare il campione bioptico in soluzione fisiologica. Tagliare il campione in due-sei pezzi più piccoli usando una lama sterile in una capsula di Petri di vetro mentre si è immersi nella soluzione fisiologica. Trasferire il campione tagliato a cubetti e un millilitro di soluzione salina in cui è stata conservata la biopsia cutanea in cinque millilitri di terreno preriscaldato integrato con antibiotici e incubare a 33 gradi Celsius.
Per fare piastre, riscaldare 300 millilitri di 1,5x BSK o MKP Complete mezzo senza gelatina. Anche caldo 200 millilitri di 1,7% agarosio a 55 gradi Celsius. Mescolare i liquidi e pipettare 15 millilitri ciascuno su 16 piastre di Petri profonde per ottenere lo strato di agar inferiore.
Mantenere il resto del mezzo a bagnomaria. Quantificare la densità di coltura Borrelia e diluire alla densità desiderata in un mezzo liquido. Dopo che le piastre inferiori si sono solidificate, aggiungere 10 millilitri della miscela di agar rimanente come agar superiore a un tubo da 15 millilitri contenente il numero appropriato di spirochete.
Versare la sospensione sulla piastra di agar inferiore nella capsula di Petri etichettata. Dopo che le piastre sono solidificate, chiuderle e posizionarle capovolte a 34-35 gradi Celsius in anidride carbonica al 2,5%. Se preparato correttamente, il mezzo BSK appariva rosso-arancio e chiaro.
Per confronto, qui viene mostrato anche il mezzo non vaccinato MKP. La crescita eccessiva da parte di batteri concorrenti genera torbidità e materiali raggruppati nel mezzo. La crescita batterica è stata monitorata mediante ispezione visiva mediante contrasto di fase o microscopia in campo oscuro.
Nella fase esponenziale, le cellule di Borrelia sono tipicamente sottili, attorcigliate e modali in una certa misura. Man mano che le culture entrano nella fase stazionaria, i corpi rotondi sono sempre più evidenti. Le cellule di Borrelia sono fastidiose e ogni specie e ceppo e persino isolato differisce sia geneticamente che attraverso l'adattamento all'ospite da cui sono state isolate.
Quando si realizzano i media, gli ingredienti appropriati fanno un'enorme differenza nel vigore della cultura Borrelia o persino nella vitalità della cultura. Le spirochete Borrelia sfidano la cultura, ma la cultura è possibile. La cultura in laboratorio è il trampolino di lancio per la ricerca sulla biologia di questi batteri.
La coltura fornisce il materiale per comprendere il genoma, il proteoma, l'evoluzione e le interazioni dei patogeni ospiti delle specie Borrelia. La coltura di Borrelia può richiedere diverse settimane prima che le spirochete siano sufficientemente abbondanti per il rilevamento. Ciò limita le applicazioni di diagnostica.
Ma la cultura può mostrare se le specie di Borrelia sono presenti, vitali e replicanti, e può aiutare ad accedere ai trattamenti.
