Gli SNX-BAR sono proteine rimodellanti a membrana che svolgono un ruolo chiave nelle malattie umane. Utilizzando i nostri metodi, possiamo determinare le loro precise proprietà biofisiche per facilitare il legame lipidico e il rimodellamento della membrana. Purificare le proteine SNB-BAR dalle cellule di lievito consente l'acquisizione di dimeri nativi homo ed hetero SNX-BAR riducendo al minimo la tossicità e l'insolubilità frequentemente incontrate con sistemi di espressione non nativi.
I nostri metodi possono essere utilizzati per comprendere le specificità lipidiche di tutti i lieviti SNX-BAR o per produrre proteine SNX-BAR ricombinanti da qualsiasi altro organismo. Un corretto assemblaggio di estrusori è essenziale per prevenire la perdita di liposoma durante il processo di estrusione. Per gli studenti che iniziano o quelli nuovi sul campo, osservare visivamente i passaggi più critici migliorerà notevolmente le tue possibilità di successo.
Inizia inoculando un grande tampone di cellule di lievito in un pallone almeno quattro volte il volume della coltura contenente 50 millilitri di mezzo YP standard integrato con 2%raffinosa e 0,1% di glucosio come fonte di carbonio e far crescere la coltura durante la notte in uno shaker di 30 gradi Celsius. La mattina seguente, inoculare la precoltura di 50 millilitri in un litro di mezzo YP standard con 2%raffinosa e 0,1% di glucosio in un pallone Fernbach sconcertato da 2,8 litri per una coltura di quattro o cinque ore nell'incubatrice di scuotimento. Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,2, aggiungere galattosio a una concentrazione finale del 2% alle cellule per una coltura notturna nell'incubatore di scuotimento.
La mattina seguente, raccogliere le cellule per centrifugazione e trasferire il pellet di lievito in un tubo conico da 50 millilitri. Resuspend il pellet in 15 millilitri di tampone di purificazione per ottenere un volume finale di circa 30 millilitri e caricare la sospensione cellulare su un omogeneizzatore refrigerato a quattro gradi Celsius. Lisciviare i campioni da 20 a 25.000 libbre per pollice quadrato per due o tre colpi e trasferire il lisato in un nuovo tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio.
Cancellare immediatamente il llysate cellulare mediante centrifugazione e trasferire con cura il supernatante in un nuovo tubo. Successivamente, equilibrare 300 microlitri di perline di sefarose IgG con tre ri-sospensioni nel tampone di purificazione prima di aggiungere le perline al lisato di cellule cancellate per un'incubazione di due ore con rotazione a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, aggiungere le perline a una colonna cromatografica da 10 millilitri e lasciare scorrere il lisato non legato.
Lavare le perline 10 volte con un millilitro di tampone di lavaggio per lavaggio consentendo a ogni lavaggio di fluire completamente prima di aggiungere il volume successivo. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pipetta e un tampone fresco per trasferire le perline in un tubo di microcentrifugo. Portare il volume totale delle perline a 500 microlitri con tampone di lavaggio fresco e rimuovere le perline dal lisato con due microlitri di 10 milligrammi per millilitro proteasi TEV per un'incubazione notturna con rotazione a quattro gradi Celsius.
La mattina seguente, utilizzare un ago calibro 27 per rimuovere completamente il supernatante e valutare la purezza delle proteine della pagina SDS del 10%poliacrilammide. Quindi quantificare le proteine concentrate usando il saggio proteico di Bradford secondo protocolli standard e conservare la proteina per un massimo di una settimana a quattro gradi Celsius. Per preparare i liposomi, utilizzare siringhe di vetro per trasferire lipidi stock in un tubo di coltura del vetro pulito per ottenere una miscela lipidica finale di 1%fosfatidilinositolo-3-fosfato, 20% ergosterolo, 30%fosfatidilserina, fosfatidilcolina come delineato nella tabella.
A seconda dei solventi in cui ogni lipide viene rimosorsi, la miscela può diventare torbosa all'aggiunta di ogni lipide. Asciugare con cura le miscele lipidiche dirigendo il gas azoto a basso flusso alle miscele con un movimento circolare per trattare i lipidi in modo uniforme nella parte inferiore del tubo di vetro. Quindi avvolgere il tubo di coltura del vetro con un foglio lasciando l'apertura scoperta e disidratare ulteriormente i lipidi nel vuoto per un'ora.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 400 microlitri di tampone legante ad ogni flaconcino per reidratare completamente i lipidi ad una concentrazione finale di liposoma di 2,5 millimolare prima di rimospendere i lipidi a media velocità su un vortice a temperatura ambiente per 30 minuti. Il tampone dovrebbe diventare torbido man mano che i lipidi vengono rimorsi. Trasferire i liposomi rimescolati in un tubo di microcentrifugo e congelare i tubi in azoto liquido seguito dallo scongelamento in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius da sette a otto volte.
In una cappa chimica, pulire due siringhe di vetro millilitro con un volume completo di cloroformio tre volte per siringa per rimuovere eventuali lipidi residui ed equilibrare ogni siringa con due volumi di acqua ultrapura e due volumi di tampone legante. Assemblare un mini-estrusore secondo le raccomandazioni del produttore. Quindi immergere due pezzi di supporto del filtro in una membrana da 200 nanometri in tampone di legame.
È importante assemblare il mini-estrusore in modo che sia completamente ermetico. E un buon modo per verificare la presenza di perdite è passare il buffer attraverso il dispositivo. Inserire la membrana tra i supporti del filtro e posizionare la membrana nel mini-estrusore.
Utilizzando una delle siringhe equilibrate da un millilitro, passare un volume di tampone di legame simile al volume della miscela liposoma attraverso il mini-estrusore e utilizzare l'altra siringa per far cadere la miscela liposoma invertendo il tubo di microcentrifugo per raccogliere l'ultimo dei liposomi nel tappo del tubo per la loro raccolta. Quindi estrudere i liposomi attraverso la membrana di 200 nanometri da 19 a 21 volte e raccogliere i liposomi estrusi in un nuovo tubo di microcentrifugo. Prima di eseguire i test di legame liposoma e tubulo SNX-BAR, pre-cancellare la proteina purificata mediante ultracentrifugazione e trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo senza disturbare il pellet.
Successivamente, incubare quattro micromolari di SNX4-ATG20 purificato e 2,5 millimolare di liposomi in un volume di reazione totale di 20 microlitri per un'incubazione di 30 minuti a 30 gradi Celsius. Per visualizzare e quantificare la tubulolazione liposoma, al termine dell'incubazione, individuare immediatamente i campioni su una griglia di rete di rame rivestita di carbonio e macchia negativa con acetato di 1%ernile. Quindi analizzare i campioni su un microscopio elettronico a trasmissione a 200 kilovolt.
Per legare e sedimentare il liposoma, trasferire 20 microlitri della reazione a un tubo di centrifuga in policarbonato e far girare il campione con un router compatibile in un ultracentrifugo. Al termine della centrifugazione, trasferire con cura il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo e rimescolare il pellet in 40 microlitri del tampone del campione della pagina SDS. Trasferire la sospensione del pellet su un nuovo tubo di microcentrifugo e aggiungere 20 microlitri di tampone del campione al supernatante.
Quindi caricare volumi di campioni equivalenti di pellet e supernatante su un gel di pagina SDS di poliacrilammide al 10% ed eseguire la colorazione Coomassie per visualizzare gli SNX-BAR legati ai liposomi. Per verificare la corretta induzione dell'espressione SNX-BAR, una macchia occidentale contro il tag di purificazione dell'affinità tandem può essere utilizzata poiché i livelli proteici degli SNX-BAR potrebbero non essere rilevati tramite macchia coomassie. Dopo la purificazione dell'eterodimero SNX-BAR, le bande dei due SNX-BAR dovrebbero apparire in un rapporto stechiometrico uno a uno e ci dovrebbero essere bande contaminanti da poco a nessuna.
In questa analisi rappresentativa, gli eterodimeri SNX-BAR sono stati espressi, purificati e legati a liposomi sintetici come dimostrato. Si noti che MVP1 formava omodimeri ed era espresso nei batteri come previsto. L'associazione SNX-BAR a diverse composizioni liposomiche potrebbe essere quantificata mediante densitometria per valutare gli effetti della fosfatidilserina, ad esempio sul legame liposoma.
L'imaging a microscopia elettronica consente la misurazione dei tubuli liposomi SNX4-ATG20 con la maggior parte dei tubuli che in genere possiedono diametri tra 14 e 26 nanometri. Si noti che gli SNX-BAR purificati possono essere ricostituiti con complessi di cattura del carico su liposomi per capire come i gruppi completi possono influenzare il rimodellamento delle membrane. Quando si confronta il legame di diverse combinazioni di dimeri SNX-BAR purificati con liposomi sintetici composti da diversi lipidi, le proteine SNX-BAR sono state trovate in possesso di distinte preferenze di legame lipidico.
Lavorare sempre in una cappa quando si maneggia cloroformio e assicurarsi di indossare i DPI appropriati quando si maneggiano taglienti o materiale di vetro.
