Il test ACT1-CUP1 può identificare se una mutazione influenza lo splicing dell'RNA pre-messaggero e dare un'indicazione di quale fase di splicing è più colpita. Il saggio ACT1-CUP1 collega la mutazione del fattore di splicing al suo impatto sul complesso processo di splicing. Utilizza la semplice lettura del fenotipo di crescita e ha un ampio intervallo di sensibilità.
L'uso efficiente del tempo è importante quando si esegue un test ACT1-CUP1. Inizia con un test da cinque a 10 ceppi per ridurre al minimo le aberrazioni di crescita indotte dallo stress. A dimostrare il processo saremo io e Isabelle Marasigan, una ricercatrice universitaria del mio laboratorio.
Per iniziare, aggiungere 790 milligrammi di agar e una mescola bar a ciascuna bottiglia. In un grande becher, preparare il terreno di crescita della leucina dropout per tutte le lastre di rame da versare. Ciò include 265 milligrammi di base azotata di lievito, 64 milligrammi di miscela dropout, meno leucina e 34 millilitri di acqua deionizzata per ogni piastra da versare.
Mescolare per sciogliere Quindi, aggiungere 34 millilitri della soluzione di terreno di crescita dropout di leucina a ciascuna bottiglia da 100 millilitri preparata e tappare con un foglio di alluminio. Successivamente, autoclave per sterilizzare e sciogliere l'agar, utilizzando il ciclo liquido consigliato per l'autoclave. Il più rapidamente possibile dopo l'autoclave, aggiungere quattro millilitri di glucosio al 20% in ciascuna bottiglia.
Quindi, abbinare l'etichetta del tubo all'etichetta della bottiglia per aggiungere le diluizioni di due millilitri di solfato di rame ciascuna alla bottiglia prevista. Utilizzando una piastra mescolare, mescolare per circa 30 secondi e versare o pipettare 35 millilitri nella piastra etichettata, evitando bolle. Per ceppo di lievito, aggiungere nove millilitri di terreno di crescita dropout di leucina e un millilitro di glucosio al 20% in un tubo conico sterile da 50 millilitri.
Usando un bastoncino sterile, o una punta per pipetta, raccogliere un piccolo campione di lievito e inoculare il supporto. Quindi, scuotere tutte le colture notturne a 180 RPM e 30 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 100 microlitri di coltura a una cuvetta, contenente 900 microlitri di acqua per ceppo.
Successivamente, misurare la densità ottica con uno spettrofotometro e calcolare la diluizione richiesta per essere a una densità ottica di 0,5 in un volume finale di due millilitri. Quindi, diluire ogni ceppo a densità ottica 0,5 in 10% glicerolo e rimisurare la densità ottica per confermare che la densità cellulare rientra nell'intervallo desiderato. Dopo aver impostato una posizione di lavoro sterile, accendere un bruciatore Bunsen.
Per un replicatore a 48 pin, pipettare 200 microlitri di ciascun ceppo diluito in un pozzetto separato di una piastra a 96 pozzetti e riempire gli spazi vuoti nella griglia sei per otto con 200 microlitri di glicerolo al 10%. Quindi, immergere il replicatore in un piatto poco profondo di etanolo al 95% e fiamma per sterilizzare. Lasciare raffreddare per almeno due minuti dopo che la fiamma si è spenta per evitare che il calore urti le cellule.
Posizionare quattro piastre vicino al bruciatore e rimuovere i coperchi. Immergere il replicatore nella piastra a 96 pozzetti e sollevarlo con un movimento rapido. Quindi, posizionare delicatamente sul piatto e dondolare leggermente avanti e indietro per facilitare un buon trasferimento.
Solleva con un movimento rapido e posizionalo esattamente nello stesso orientamento nella piastra a 96 pozzetti. Dopo che una piastra è stata placcata, spostati con un movimento graduale di lato, ma ancora all'interno dell'ombrello di sterilizzazione della fiamma. Lasciare asciugare completamente i piatti prima di posizionare i coperchi, di solito da tre a cinque minuti.
Quindi, incubare le piastre per tre giorni a 30 gradi Celsius. Dopo aver rimosso le piastre dall'incubatore, ispezionarle visivamente. Il test di crescita ha dimostrato che all'aumentare della concentrazione di rame, i ceppi con giunzione inferiore, mostrano una diminuzione della confluenza, al punto in cui la concentrazione di rame diventa letale.
Lo sfondo del lievito include un gene ADE2 interrotto, con il risultato che le colonie sono di varie tonalità di rosso. E le colonie mature erano di colore rosso intenso. Durante la placcatura, se il replicatore viene sollevato mentre si muove a sinistra o a destra, portato ad angolo o se scosso sopra la piastra, è possibile creare colonie di forma ovale o micro colonie da piccole goccioline di soluzione cellulare.
Il lievito con il reporter A3c è sopravvissuto a 0,15 millimolari di rame mentre le cellule reporter wild-type hanno mantenuto la vitalità fino alla fine dell'intervallo di concentrazioni di rame testate. I risultati del test hanno mostrato che le diverse basi nella posizione 57 dell'snRNA U6 hanno impatti unici sullo spliceosoma in combinazione con una mutazione del sito 5 primo o ramificato. Mentre U57c è una mutazione additiva, diminuendo la tolleranza al rame, in combinazione con A3c e i reporter G del sito di filiale.
Al contrario, U57a aumenta la tolleranza al rame perché promuove la progressione verso il secondo stadio. Dopo che la perturbazione dello splicing è stata identificata attraverso ACT1-CUP1, la ricerca può passare a metodi più quantitativi, come l'estensione del primer e l'identificazione dell'interazione molecolare interrotta attraverso EMSA e sondaggio enzimatico. ACT1-CUP1 è stato un test fondamentale, che ha costruito la nostra comprensione della robustezza e della selettività dello spliceosoma del lievito.
E continua ad espandere la nostra comprensione della funzione spliceosomale.
