La rigenerazione endogena del cuore è un processo dinamico che coinvolge più tipi di cellule che lavorano insieme di concerto per montare una robusta risposta rigenerativa. Scrutare il tessuto rigenerante attraverso l'imaging 3D del cuore sgombrato in risposta alle lesioni può aiutare nella ricostruzione della dinamica cellulare che guida questa risposta rigenerativa cardiaca. Il nostro protocollo è specificamente progettato per tracciare le cellule durante lo sviluppo e la rigenerazione.
Non prevediamo alcuna limitazione nell'applicazione ampia delle nostre tecniche di compensazione, colorazione e imaging ad altri tipi di organi. Per l'occlusione coronarica indotta da LAD, sterilizzare prima l'area chirurgica di un cucciolo neonatale anestetizzato di un giorno con soluzione antisettica. Fai un'incisione cutanea trasversale nella regione toracica.
Per separare la pelle dal muscolo, utilizzare un paio di forcep di medicazione per sollevare la pelle con attenzione mentre si premono delicatamente le forbici contro i muscoli intercostali in posizione chiusa. Individuare il quarto spazio intercostale e utilizzare piccole pini per fare una piccola puntura superficiale facendo attenzione ad evitare gli organi interni. Usando la dissezione smussata e le forcep di medicazione, allargare l'area tra i muscoli intercostali fino a quando un dito può essere applicato sul lato sinistro dell'addome tenendo aperto lo spazio intercostale con le forcep di medicazione per guidare delicatamente il cuore fuori dalla cavità toracica.
Una volta estratto il cuore, lasciare riposare il cuore sui muscoli intercostali e localizzare il LAD come regione del cuore con meno sangue in pool. Per indurre l'infarto del miocardio, utilizzare una sutura 6-0 per legare saldamente un nodo quadrato intorno al vaso due volte senza recidere l'arteria. Lo sbiancamento all'apice deve essere osservato immediatamente.
È importante rimanere coerenti sul posizionamento della sutura lungo il LAD per una dimensione infarct simile. Questo si ottiene al meglio accedendo rapidamente al cuore mentre il sangue scorre ancora attraverso le arterie. Quando la sutura è stata posizionata, lasciare che il cuore scivoli di nuovo nella cavità toracica.
Suturare le costole insieme a un chirurgo e un nodo quadrato usando forcep smussate per sollevare il set superiore di costole mentre si passa una sutura 6-0 attraverso il set superiore e inferiore di costole. Applicare un piccolo volume di colla cutanea sull'addome superiore e utilizzare forcep fini per posizionare la pelle dell'addome inferiore sulla regione toracica esposta. Quindi posizionare il cucciolo su una pastiglia riscaldante ed eseguire la legatura sull'animale successivo.
Una volta eseguiti tutti gli interventi chirurgici, riportare i cuccioli caldi e mobili nella gabbia di casa della madre. Per la chiarezza passiva del tessuto cardiaco raccolto, 21 giorni di postchirurgia dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, posizionare il mouse su un'area chirurgica pulita in posizione supina e fissare gli arti con nastro adesivo. Usando le forcelle tissutali, afferrare la pelliccia appena sotto il processo xifoide e fare un'incisione che copre la larghezza della gabbia toracica.
Tagliare insieme alle porzioni distali della gabbia toracica e utilizzare le forcep per sollevare il processo xifoide per esporre il diaframma. Staccare il diaframma con forcelle curve e tirare il tessuto cranicamente fino a quando il cuore pulsante non è accessibile. Usa le forcep curve per afferrare il cuore alla base e usa le forbici iridectomia per tagliare l'aorta e la vena cava superiore.
Posizionare il cuore pulsante in una piastra di Petri di PBS in modo che il cuore pompa il sangue trattenuto. L'infarto miocardico può essere confermato da un corretto posizionamento anatomico della legazione LAD. Quando il cuore smette di battere, spremere delicatamente l'organo con le forcep per espellere il sangue residuo e trasferire il campione in una fiala monouso in vetro da 2,5 millilitri contenente due millilitri di PBS.
Posizionare il flaconcino su uno shaker per almeno 30 minuti a temperatura ambiente cambiando la soluzione PBS ogni 10 minuti fino a quando la soluzione rimane libera dal sangue. Quando il PBS è chiaro, sostituire il PBS con due millilitri di paraformaldeide fredda al 4% per un'incubazione di quattro ore a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi di 10 minuti sullo shaker con due millilitri di PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, riempire il flaconcino con due millilitri di acrilammide al 4% integrati con soluzione 0,5%VA-044 per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.
Il giorno dopo, posizionare la fiala in un blocco di calore di 37 gradi Celsius per tre ore. Al termine della polimerizzazione, trasferire il cuore in una nuova fiala di vetro e lavare il tessuto cardiaco in due millilitri di PBS fresco 10 minuti alla volta rinfrescando il PBS alla fine di ogni incubazione. Quando il PBS è chiaro, sostituire il tampone di lavaggio con due millilitri di soluzione di compensazione.
Incubare il campione a 37 gradi Celsius per diverse settimane fino a quando il cuore non è limpido, rinfrescando la soluzione di compensazione ogni due o tre giorni. Quando l'organo è chiaro, lavare il campione con PBS sullo shaker come dimostrato prima di riempire il flaconcino con PBS fresco per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il PBS con RIMS per un'incubazione 24 ore su 24 a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, il tessuto è completamente eliminato. Il tessuto dovrebbe diventare trasparente dopo diverse settimane. Per l'imaging del cuore del topo postnatale cancellato dopo l'induzione dell'infarto del miocardio, riempire metà di una camera di uno scivolo depressionario su misura con PBS e utilizzare forcep curve per trasferire con cura il cuore ripulito nella camera.
Riempire il volume rimanente della camera con PBS. Quindi riempire la camera con PBS fino a quando la superficie del liquido forma una cupola sopra la parte superiore della camera e montare lo scivolo di copertura prima di immaginare il tessuto mediante microscopia confocale secondo protocolli di imaging standard. Se la puntura e la dissezione smussata sono troppo vicine in prossimità dello sterno, il cuore potrebbe non essere in grado di uscire dalla cavità toracica.
Se il cuore non esce facilmente dalla cavità, applicare pressione sull'addome sinistro per facilitare il processo. Possono verificarsi complicazioni dal riposo del cuore sui muscoli intercostali. Pertanto, è importante mantenere la dissezione smussata a una dimensione minima in un orientamento orizzontale per consentire una visualizzazione chiara e l'accessibilità del LAD.
Si noti che una legatura superficiale avrà meno spazio per la regolazione nel posizionamento finale della sutura e che la sutura che lega intorno al LAD deve essere eseguita con movimenti costanti controllati. Entro la fine del passaggio di compensazione, l'intero cuore dovrebbe essere costantemente opaco senza scolorimento al centro. Dopo alcuni giorni in soluzione RIMS a temperatura ambiente, il cuore deve essere completamente eliminato e può essere osservata una certa espansione dei tessuti.
Come osservato dall'espressione proteica tdTomato reporter, i nervi cardiaci sono principalmente superficiali con alcune popolazioni residenti nello strato epicardiale. È importante sottolineare che la conferma dell'espressione proteica del reporter viene preservata dopo aver subito il protocollo di chiarezza come dimostrato. La pulizia e l'imaging del cuore 3D fornisce una prospettiva nella posizione e nella morfologia delle popolazioni di cellule cardiache.
Questo ci permette di identificare nuovi aspetti nella creazione di modelli cellulari e nelle interazioni cellula-cellula.
