Parassiti della malaria come incontrati dalle zanzare che svolgono un ruolo importante nella diffusione della malattia. Finora, è stato impossibile allevare zanzare antimalarica senza sangue. E per superare questa limitazione, il nostro protocollo descrive una dieta sostitutiva del sangue che è in grado di supportare l'allevamento di zanzare nell'insettoriale.
L'uso di una dieta priva di sangue è altamente vantaggioso rispetto al sangue. Una dieta priva di sangue non ha i vincoli etici come l'uso di sangue umano o animali da esperimento. Sostituire gli animali nella sperimentazione fa parte della nostra politica delle tre R.
Sostituire, ridurre, perfezionare. Il non utilizzo di sangue riduce i costi e la logistica associata alla raccolta, conservazione e manutenzione del sangue rosso. L'uso di diete artificiali può facilitare il test di molecole anti plasmodio.
Fino ad ora, abbiamo testato le nostre diete utilizzando diverse specie di anopheles. In tutti loro, la dieta era ben ingoiata dalle femmine e consentiva la produzione e la deposizione delle uova. Crediamo che questa dieta abbia un potenziale uso per l'allevamento di altre specie di zanzare.
In realtà, ora lo stiamo testando per le aedes, un vettore di molte malattie come la febbre dengue, il virus Zika o la febbre gialla. Mantenere le zanzare a ceppo di anopheles coluzzii yaonde in una stanza a 26 gradi Celsius, umidità del 75% e sotto un ciclo buio chiaro da 12 ore a 12 ore. Ospita le zanzare usando condizioni insettoriali standard in un'unica gabbia per garantire l'accoppiamento.
Usa una pipetta di plastica per raccogliere pupe di zanzara in un piccolo contenitore d'acqua. Posizionare il contenitore all'interno di una gabbia per zanzare per far emergere e accoppiare le zanzare adulte. Fornire una soluzione di alimentazione del glucosio al 10% nella gabbia.
Tre giorni dopo l'emergenza, usa un aspiratore per raccogliere il numero necessario di femmine dalla gabbia di scorta in un foglio di carta. Per distinguere, le femmine sono più grandi e i maschi hanno una proboscide più ampia e piumata. Un giorno prima di nutrire le tracce, rimuovere la soluzione di alimentazione del glucosio al 10%.
Il giorno successivo, preparare diete liquide artificiali in condizioni sterili nell'armadio a flusso laminare secondo il manoscritto. Aggiungere tutti gli ingredienti a un tubo di plastica. Mescolare accuratamente tutti gli ingredienti e filtrare utilizzando un microfiltro da 0,45 micron.
Riempire una siringa sterile da 1 millilitro dotata di un ago da mezzo pollice calibro 27 con 100 microlitri di un milligrammo per millilitro eparina. Quindi, anestetizza da sei a otto settimane CD un topo femmina con chetamina e xiazina usando la via intra peritoneale. Valutare se il mouse mostra una reazione muscolare e una risposta a diversi stimoli fisici.
Eseguire la puntura cardiaca. Quindi raccogliere il sangue dal topo in un micro tubo e mantenere il sangue a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Successivamente, raccogli circa 30 zanzare femminili dalla gabbia di stoccaggio usando un aspiratore.
Trasferisci le zanzare femminili in tazze di carta da 500 millilitri e copri con una sottile rete di zanzariere in modo che non possano fuggire. Allungare la membrana del parafilm attraverso la bocca dell'alimentatore di vetro per contenere il pasto. Applicare un apparecchio di alimentazione artificiale a campana di vetro collegato a tubi di plastica sulla parte superiore di ogni tazza.
Fornire un flusso d'acqua costante ai tubi cilindrici e all'alimentatore in modo che la temperatura all'interno sia mantenuta a circa 37,5 gradi Celsius. Applicare un millilitro di dieta liquida prebellita a 37 gradi Celsius o sangue di topo fresco in un alimentatore di vetro. Nutrire le zanzare per 60 minuti al buio in 26 gradi Celsius.
Dopo l'alimentazione artificiale, anestetizza freddamente le zanzare a 20 gradi Celsius per 30 secondi. Quindi, metti le zanzare in una piastra di Petri refrigerata. Registra il numero di zanzare femminili completamente ingoiati.
Separa 30 femmine completamente ingoiate e mettile su una nuova gabbia. Ora, posizionare una carta filtrante umidificata nella parte inferiore di ogni gabbia. Mantenere le zanzare a 26 gradi Celsius, 75% di umidità e sotto un ciclo buio chiaro da 12 ore a 12 ore con 10% glucosio ad libitum.
A 96 ore e 120 ore dopo l'alimentazione, contare le uova con l'aiuto di una lente d'ingrandimento portatile. Inondare la carta filtrante con acqua distillata per raccogliere le uova in vassoi pieni di acqua distillata. Nutrire le larve ogni giorno con circa 13 milligrammi di cibo macinato per vassoio.
Rimuovere le pupe morte e le larve con una pipetta di plastica ogni giorno. Quando tutte le pupe si sono sviluppate in adulti, conta il numero di maschi e femmine adulti, registra le date di schiusa e morte e calcola i tassi di mortalità. Per testare la longevità, raccogli 15 maschi adulti e 15 femmine adulte della generazione F1 di ogni gruppo dietetico in un foglio di carta.
Nutrire gli adulti con soluzione di glucosio al 10% ad libitum. Usa una pinzetta o un pennello per rimuovere quotidianamente gli adulti morti. Mantenere le zanzare alla stessa temperatura, umidità, condizioni del ciclo leggero e regime di alimentazione dello zucchero.
Registrare le date di morte e calcolare la longevità. Per misurare la lunghezza delle ali, anestetizza freddamente le zanzare adulte di F1 di cinque giorni maschili e femmine di ogni gruppo dietetico a 20 gradi Celsius per 90 secondi. Sotto uno stereoscopio, afferrare delicatamente il torace di ogni zanzara con le forcep e posizionarle lato ventrale verso l'alto.
Raccogli entrambe le ali usando un bisturi e posizionale su uno scivolo al microscopio pulito contenente una goccia essiccata di mezzo di montaggio per ulteriori misurazioni utilizzando un oculare graduato. Misurare la lunghezza dell'ala con uno stereoscopio utilizzando un micrometro. In questo studio, le prestazioni delle zanzare anopheles femminili nutrite con il ricco pasto artificiale formulato e le zanzare alimentate con la dieta liquida iniziale, o un pasto di sangue fresco è stato confrontato.
Il numero di zanzare femminili ingoiate alimentate con ricchi pasti artificiali all'89% era significativamente superiore al numero di femmine ingoiate nutrite di sangue al 56%La generazione di zanzare F1 alimentate con il sangue o il ricco pasto artificiale aveva tassi di mortalità e sopravvivenza comparabili. La variabilità era più alta nel sangue alimentato zanzare rispetto alle zanzare nutrite con il ricco pasto artificiale. In termini di dimensioni corporee adulte, le zanzare anopheles F1 alimentate con ricco pasto artificiale erano entro l'intervallo previsto ed erano simili alle zanzare insettoriali alimentate a sangue.
A mio parere, è molto importante assemblare correttamente gli alimentatori con il parafilm per evitare la sua rottura. Se la membrana non è ben attaccata all'alimentatore di vetro, puoi perdere il pasto e probabilmente perdere alcune delle zanzare in quanto possono essere coperte dal pasto e morire. Vorremmo eseguire un saggio di attrazione a doppia scelta, ad esempio usando un olfattometro in modo da poter effettivamente valutare se le nostre femmine sono più attratte dalla dieta artificiale o dal sangue.
Inoltre, ora stiamo liofilizzando la dieta artificiale e studiando la sua stabilità tra temperature diverse da molto tempo. Oltre agli ovvi miglioramenti alla stabilità e allo stoccaggio su cui abbiamo lavorato, l'uso a lungo termine della dieta sulla forma fisica e la fisiologia delle zanzare dovrebbe essere studiato. Credo che produrre gli anopheles senza sangue faciliterà immensamente la ricerca vettoriale e l'implementazione di strumenti di controllo che dipendono da un gran numero di zanzare.
