Come importante elemento minerale, il calcio svolge un ruolo chiave nella crescita e nel controllo di qualità dei frutti degli alberi come la mela, può regolare la durezza, il contenuto di zucchero, il periodo di conservazione e il disturbo fisiologico durante la conservazione. L'imaging del calcio è il metodo più occidentale per rilevare i cambiamenti dinamici negli ioni calcio nel citoplasma. Gli indicatori fluorescenti a piccole molecole, come fluo-4 / AM hanno una selettività specifica dello ione calcio e possono essere caricati in modo non invasivo mediante incubazione dell'esterificazione, che è flessibile, rapida e non citotossica.
Questo protocollo introdurrà un metodo per caricare il reagente fluorescente chimico a piccole molecole fluo-4/AM nei protoplasti vegetali. Estrazione di protoplasti Aggiungere 0,5 millilitro di soluzione enzimatica in un tubo centrifugo da 1,5 millilitro. Scegli una mela sana e matura, quindi affetta la polpa in 10 volte 5 volte 1 millilitro cubo.
Posizionare i pezzi di polpa in soluzione enzimatica, quindi chiudere il tubo. Incubare il tubo a 28 gradi per un'ora. Baraccato a 70 giri al buio.
Successivamente, lavare i pezzi di polpa, aspirare tutta la soluzione enzimatica e quindi aggiungere una soluzione di base da 0,5 millilitro. Centrifugare ad una velocità di 300 g per 2 minuti. La sospensione di Protoplasts può essere ottenuta aspirando la soluzione inferiore.
Colorazione del reagente di fluorescenza chimica a piccola molecola. Preparare la soluzione di carico fluo-4/AM con un fluo-4/AM da 2 millimolari, il 20% di etile127 e la soluzione salina tamponata con fosfato 10X in un rapporto uno a uno a due. Aggiungere 1 soluzione di carico di microlitro di fluo-4/AM a 99 microlitteri protoplasto sospensione.
La concentrazione finale di coloranti fluorescenti è di 5 micromolari. Mescolare la soluzione, quindi chiudere il tubo. Allo stesso tempo, ferro lantanio il calcio o l'unicità del piccolo agente fluorescente chimico molecolare.
Aggiungere un microlitro o 10 microlitri in più di ferro lantanio e poi una soluzione di carico di microlitro di fluo-4/AM a 98 microlitri protoplasti sospensione. La concentrazione finale di ferro lantanio è di 100 micromolari. Mescolare la soluzione, quindi chiudere il tubo.
Incubare a 37 gradi per 30 minuti al buio. Successivamente, centrifugare alla velocità di 300 G per due minuti. Aspirare fino a 17 microlitri e aggiungere una soluzione di base da 17 microlitri.
Incubare la sospensione del protoplasto a 37 gradi per 30 minuti a completamente Dopodiché, aspirare la sospensione di protoplasti da 50 microlitri e gocciolare su un vetrino. Osservare al microscopio a fluorescenza. Selezionare il 20x l'ingrandimento e il canale GFP da osservare.
Regolare uniformemente la luminosità a 0,5. Un passo fondamentale in questo metodo proposto è quello di lavare la macchia nei protoplasti e incubarli per 30 minuti. Un lavaggio insufficiente provoca un eccessivo sostegno sulla fluorescenza durante l'osservazione e l'incubazione consente un migliore carico o la sonda nel citoplasma.
Protoplasts Viability Assay Prendere 99 microliter protoplasts sospensione dopo l'incubazione a 37 gradi per 30 minuti. Aggiungere 1 ml alla soluzione FD alla sospensione di protoplasti. Mescolare la soluzione pipettando su e giù più volte e quindi chiudere il tubo.
Rimanere a temperatura ambiente per cinque minuti al buio. Preparare i vetrini e osservarli al microscopio a fluorescenza con canale GFP. Vi presentiamo i risultati Seguendo la prima figura.
Usiamo il metodo enzimatico tutti ottenendo protoplasti dalla polpa. Alcuni protoplasti avevano un vacuolo mentre altri no. I protoplasti sono stati colorati con FD per cinque minuti e mostrano la fioritura nel citoplasma indicando che l'alta temperatura, 37 gradi non influisce sulla vitalità o sui protoplasti Figura due.
I protoplasti non hanno mostrato fluorescenza in uno degli indicatori di fluorescenza dei ferri di calcio o non sono caricati in essi. Che in fluo-4 / AM è stato caricato nel protoplasto, il citoplasto, ma non un vacuolo è diventato fluorescente. I ferri di lantanio che bloccano efficacemente i canali del calcio sono la membrana cellulare sono stati aggiunti al carico fluo-4 / AM di Protoplast.
Alla concentrazione finale di 100 ferri di lantanio micromolari riducono significativamente l'intensità della fluorescenza del calcio. Questi risultati hanno ulteriormente dimostrato che il fluo-4 / AM rimane efficacemente nei ferri di calcio nel citoplasto e mostra cambiamenti dinamici nel contenuto di ferro di calcio. Figura tre I risultati fluo-4/AM sono stati analizzati utilizzando la colorazione fluo-4/AM del software IMH approved plus 6.0 con aggiunta di ferri lantanio che ha ridotto significativamente il valore di florescenza dei ferri da calcio citoplasmatici.
In questo video, tutti i protoplasti sono stati ottenuti per idrolisi enzimatica. Abbiamo caricato con successo le sonde fluorescenti in un protoplasto a 37 gradi. Inoltre, il metodo non ha influenzato la vitalità dei protoplasti.
In sintesi, il metodo qui descritto in natura dettagliato. I cambiamenti dinamici negli ioni calcio citoplasmatico nelle cellule della polpa di mela forniscono così 10 supporti uguali per l'ulteriore scopo di studi relativi al calcio.
