Il protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala e il doppio tag mGFPHis forniscono un metodo economico, veloce, affidabile e facile per caratterizzare le proteine di membrana nell'organismo modello eucariotico, Saccharomyces cerevisiae. Il più grande vantaggio di questa tecnologia è la facilità e la velocità con cui è possibile determinare i livelli di espressione proteica della membrana, le attività dell'ATP e il detergente più adatto per la loro purificazione. Questa tecnologia è molto facile da usare.
Tuttavia, un punto importante da ricordare è quello di raccogliere le cellule come OD 600 di 2, che garantisce una bassa contaminazione mitocondriale e le più alte attività ATPasi possibili. Inizia pre-coltivando una singola colonia di lievito in 10 millilitri di mezzo YPD a 30 gradi Celsius per sette-otto ore a 200 rotazioni al minuto. Utilizzare 10 millilitri di precoltura per inoculare 40 millilitri di terreno YPD fresco.
Quindi incubare le cellule a 30 gradi Celsius durante la notte a 200 rotazioni al minuto fino a quando la densità cellulare raggiunge un OD 600 da uno a tre. Il giorno successivo raccogliere 40 unità di densità ottica, o ODU, di cellule facciali logaritmiche centrifugando a 4.200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risespentare e lavare le celle con 40 millilitri di acqua sterile ghiacciata a doppia distillazione.
Ripetere il lavaggio utilizzando un millilitro di acqua ghiacciata con centrifugalizzazione tra le fasi di lavaggio. Sospendere di due anni il pellet in un millilitro di acqua sterile ghiacciata e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrificante da 1,5 millilitro pre-raffreddato su ghiaccio. Raccogli le cellule a 3.300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone omogeneizzante appena integrato con un millimolare fenal metil sulfa Neal fluoruro, o PMSF. Conservare la sospensione cellulare a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Scongelare le cellule sul ghiaccio per circa un'ora.
Quindi aggiungere perli di silice ghiacciate da 0,5 millimetri di diametro ai 500 microlitri della sospensione cellulare per raggiungere un volume totale di un millilitro. Per rompere le cellule, vortice la sospensione cellulare alla massima intensità di scuotimento per un minuto, per sei cicli, con un periodo di raffreddamento di tre minuti sul ghiaccio dopo ogni ciclo. Dopo il vortice, fare un foro sottile sul fondo del tubo con una lama di bisturi riscaldata e raccogliere l'omogeneo cellulare rotto in un altro tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri ghiacciato con una rotazione a bassa velocità per 10 secondi.
Centrifugare l'omogeneo cellulare raccolto a 5, 156 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire 450 microlitri di surnatante in un tubo microcentrante ghiacciato da 1,5 millilitri e aggiungere un millilitro di tampone omogeneizzante ghiacciato integrato con un PMSF fresco millimolare. Per raccogliere le membrane plasmatiche centrifugare la sospensione cellulare a 17.968 volte G per un'ora a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 microlitri di tampone omogeneizzante appena integrato con un PMSF millimolare. Quindi allentare il pellet della membrana plasmatica mescolando con la punta della pipetta da 100 microlitter e sospendere di seguito il pellet ripetendo il pipettaggio su e giù. Misurare la concentrazione proteica del preparato della membrana plasmatica con un kit di analisi delle proteine compatibile con tamponi contenenti l'agente riducente e il detergente.
Conservare le membrane plasmatiche a meno 80 gradi Celsius o tenerle sul ghiaccio per un uso immediato. Versare da quattro a cinque millilitri di gel separatore nell'apparato gel assemblato fino a due centimetri dall'alto. Sovrapporre con cura da uno a due millilitri di 0,1% SDS sulla parte superiore e lasciare che il gel di poliacrilammide si imposti per 60 minuti a temperatura ambiente.
Dopo un'ora rimuovere lo strato di SDS allo 0,1% dal gel separatore polimerizzato e risciacquare il gel con acqua doppia distillata per rimuovere tracce di SDS. Versare la miscela di gel impilante sul gel separatore. Metti un pettine nel gel impilante e rimuovi eventuali bolle d'aria intorno al pettine.
Quindi lasciare che il gel impilante si imposti per 60 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il pettine e quindi risciacquare le fessure del gel con acqua. Mettere il gel nel serbatoio del gel e riempire il serbatoio del gel fino in cima con il tampone di corsa.
Mescolare da cinque a 10 microlitri di campioni di membrana plasmatica con volumi uguali di due volte colorante a carico proteico e caricare immediatamente la miscela di campioni in singoli slot di gel, immersi nel buffer in esecuzione. Caricare i marcatori di peso molecolare delle proteine nell'intervallo da 10 a 245 Kilodalton in uno slot separato per consentire la stima delle dimensioni dei singoli frammenti proteici. Eseguire l'elettroforesi su gel a 200 volt fino a quando il colorante di carico blu raggiunge il fondo del gel.
Esaminare il gel per la fluorescenza GFP in-gel con un sistema di imaging su gel. Seguendo l'imaging fluorescente fissare le proteine in 10-20 millilitri di soluzione fissante di gel proteico mediante delicata agitazione del gel per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi risciacquare due volte per 10 minuti con 10 millilitri di acqua doppia distillata e posizionare il gel in 10 millilitri di soluzione colloidale di Kumasi con un leggero scuotimento per un'ora a temperatura ambiente per visualizzare le bande proteiche.
Per una migliore visualizzazione delle bande proteiche, demacchiare il gel una o due volte in 20 millilitri di acqua doppia distillata per un'ora prima di registrare le immagini con il sistema di imaging del gel. Un'alta frequenza di trasformazione di Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta è stata ottenuta con il plasmide di controllo positivo PS2. Non sono stati ottenuti trasformatori Eurocell Prototron per il controllo negativo.
Circa 50 prototrofi CDR1-mGFPHis trasformanti sono stati ottenuti dopo l'incubazione di cellule AD Delta Delta trasformate su piastre CSM meno URA per tre giorni. Il piccolo trasformante che non può crescere sulle piastre di agar YPG è stato eliminato. I campioni di CDR1-mGHPhi con concentrazioni variabili sono stati quantificati con fluorescenza in-gel.
Le intensità di fluorescenza mGFP erano lineari sull'intero intervallo di concentrazione con fluorescenza di fondo minima. La variazione della densità cellulare ha indicato che la rottura di 40 ODU di cellule ha prodotto la più alta qualità delle membrane plasmatiche con la più alta attività di ATPasi CDR1. Tuttavia, la resa delle membrane plasmatiche è aumentata in proporzione all'aumento delle densità cellulari.
La capacità di 31 detergenti con varie proprietà di solubilizzare CDR1-mGHPHis da membrane plasmatiche grezze di AD Delta Delta, cellule CDR1-mGHPHis sono stati testati con la pagina SDS. Beta e alfa DDM e Fos-colina 13 sono stati i migliori detergenti per solubilizzare CDR1-mGHPHis. Tuttavia, Fos-colina 13 causano idrolisi parziale di CDR1-mGHPHis.
La proteina grezza della membrana plasmatica solubilizzata con detergente all'1% è stata separata utilizzando una colonna di esclusione di dimensioni superos six aumentate di 10 300 GL. I cromatogrammi dei maltosidi e delle proteine estratte da LMNG hanno mostrato che la maggior parte dei CDR1-mGHP Eludono come un picco gaussiano di buona forma a 15,5 millimetri CDR1-mGHPHis solubilizzato con detergenti contenenti glucosio allusi come picco aggregato o aggregato ampio. I picchi più alti per DDM hanno indicato che una grande porzione di DMN G solubilizzato CDR1-mGHPHis può essere denaturato.
Nei cromatogrammi FSCC per fos-coline zwitterioniche e due detergenti non ionici solo Digitonina e ha dato un cromatogramma simile al DDM. Fos-colina 13 ha dato un picco simmetrico di forma acuta, ma alludeva con un volume di eluizione significativamente inferiore a quello per DDM. Il doppio tag ottimizzato migliora anche la resa di purificazione e ha contribuito a determinare la localizzazione, il traffico e la stabilità termica delle proteine di membrana.
La tecnologia di espressione eterologa può anche essere utilizzata nello screening farmacologico ad alto rendimento e nella caratterizzazione dettagliata di molte altre proteine di membrana.
