Abbiamo sviluppato un nuovo metodo utilizzando un analizzatore XF per cavallucci marini per misurare direttamente il tasso di consumo di ossigeno. Ma proxy comune per la funzione mitocondriale in fette di diapositiva acuta da topi adulti. Questo metodo misura un cellulare da energetica in punture da strutture cerebrali anatomicamente definite.
L'uso di fette acute imita più da vicino l'ambiente cellulare fisiologico che non può essere raggiunto nei modi in cui le cellule mitocondriali o di coltura isolate. Questo metodo sarà di ampio interesse per i ricercatori che lavorano nel campo del morbo di Parkinson e della malattia di Huntington. Per iniziare, aprire il kit di analisi del flusso extracellulare e rimuovere sia la cartuccia del sensore che la piastra di utilità.
Quindi posizionare la cartuccia del sensore da parte e non toccare i sensori. Quindi, aggiungere 600 microlitri di soluzione calibrata a ciascuna parete della piastra di utilità. Posizionare la cartuccia del sensore sopra la piastra di utilità e immergere i sensori nella soluzione di calibrazione, assicurandosi che la tacca triangolare dell'utilità e la piastra della cartuccia del sensore siano allineate correttamente.
Successivamente, sigillare il kit di analisi del flusso extracellulare con un film sigillante per evitare l'evaporazione della soluzione calibrata e quindi posizionarlo in un incubatore a 37 gradi Celsius non integrato con anidride carbonica o ossigeno, durante la notte. Aprire la micro piastra di cattura dell'occhiello ed estrarre la piastra dell'occhiello per la seduta dei tessuti. Quindi riscaldare un volume appropriato di tampone del liquido spinale cerebrale artificiale modificato pre-ossigenato a 37 gradi Celsius in un tubo da 50 millilitri.
Quindi aggiungere BSA a una concentrazione finale di quattro milligrammi per millilitro per preparare il tampone respiratorio. Aggiungere con attenzione 625 microlitri di tampone respiratorio a ciascun pozzetto della piastra dell'occhiello evitando di scuotere la piastra, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria nel tampone di ciascun pozzetto. Sezionare immediatamente il cervello in 10 millilitri di soluzione di taglio pre-ossigenata ghiacciata.
Quindi, utilizzando fette striatal coronali a sezione vibratome, seguendo le istruzioni del produttore ad uno spessore di 150 micrometri in soluzione di taglio pre-ossigenata ghiacciata. Quindi, recuperare le fette in 50 millilitri di liquido spinale cerebrale artificiale ossigenato. E tenerli in soluzione per un massimo di 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo il recupero, trasferire le fette in una capsula di Petri da 35 per 10 millimetri con cinque millimetri di tampone respiratorio. Utilizzando un punzone bioptico in acciaio inossidabile creare un pezzo circolare di tessuto nell'area desiderata del cervello affettato premendo delicatamente verso il basso il pugno mantenendo la fetta nel tampone. Quindi rimuovere il resto del tessuto, sollevare il pugno e rimuovere il pezzo circolare di tessuto nel tampone.
Quindi, tagliare l'estremità di una punta della pipetta da un millilitro per creare un foro con un diametro millimetrico da cinque a due punti zero e utilizzarlo per tenere e trasferire la fetta perforata nella parte superiore della schermata di acquisizione. Aspirare un pezzo di tessuto cerebrale perforato e posizionare con cura il tessuto sul lato mesh dello schermo di cattura, un pezzo circolare di plastica con la rete attaccata a un lato. Utilizzando un fazzoletto di carta asciugare delicatamente lo schermo di cattura e rimuovere l'umidità, che consente al tessuto di diventare appiccicoso e attaccato al centro della rete.
Quindi, tenere premuto lo schermo di cattura con una pinzetta e posizionarlo in uno dei pozzetti della piastra dell'occhiello in incubazione. Quindi incubare la piastra dell'occhiello a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per almeno 30 minuti per consentire l'equilibrio della temperatura e del pH prima di eseguire il test. Diluire i composti desiderati e il liquido spinale cerebrale artificiale modificato senza BSA alla concentrazione finale di stock della concentrazione di lavoro per le porte da A a D, rispettivamente.
Precaricare delicatamente 75 microlitri dei composti diluiti nelle porte di iniezione appropriate della cartuccia del sensore posizionando le punte a metà strada nelle porte di iniezione con un angolo di 45 gradi con la punta contro la parete della porta di iniezione, poiché l'inserimento completo può causare perdite di composto attraverso la porta. Successivamente, prelevare accuratamente le punte dalle porte senza creare bolle d'aria e non toccare alcuna parte della cartuccia per evitare di alleviare le bolle d'aria. Quindi ispezionare visivamente le porte di iniezione per un carico uniforme assicurandosi che tutto il liquido sia nella porta e che non siano presenti gocce residue sulla parte superiore della cartuccia.
Dopo aver posizionato la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità, metterla in un'incubatrice per 30 minuti per consentirle di riscaldarsi fino a 37 gradi Celsius mentre si maneggia con attenzione, tenendola solo sulla piastra di utilità e muovendosi il meno possibile. Per prima cosa caricare il modello di analisi nel software e quindi premere il pulsante di avvio verde. Quindi caricare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità nel vassoio dello strumento, assicurandosi che la piastra si trovi correttamente e sia piatta, caricando la cartuccia del sensore riempita di farmaco nell'analizzatore per la calibrazione.
Successivamente, seguire le istruzioni sullo schermo per calibrare. Ed equilibrare i sensori. Una volta terminata la fase di equilibratura, rimuovere la piastra di calibrazione e sostituirla con la piastra dell'occhiello contenente le fette di rete e tessuto.
Quindi misurare il tasso di consumo di ossigeno in ciascun pozzetto della piastra, utilizzando i protocolli di analisi descritti nel manoscritto. Successivamente, analizzare i dati di misurazione del tasso di consumo di ossigeno e i dati sull'efficienza di accoppiamento. I tassi di consumo di ossigeno per diversi spessori e dimensioni di punzonatura delle fette nel gruppo di controllo hanno mostrato una respirazione basale stabile sull'intera misurazione ed erano proporzionali al volume della fetta.
Inoltre, i tassi di consumo di ossigeno sono stati relativamente stabili per cinque ore con meno del 10% di rundown. L'efficienza di accoppiamento mitocondriale è stata confrontata e la fetta allo spessore di 150 micrometri e una dimensione del punzone di 1,5 millimetri ha mostrato la massima efficienza di accoppiamento. I tassi di consumo di ossigeno sono stati misurati per gruppi giovani e anziani di Knockout Pink1 e per i loro topi wild-type abbinati all'età.
Il tasso di consumo basale di ossigeno era simile sia nei gruppi knockout che in quelli wild-type per i topi giovani. Tuttavia è diminuito per i topi knockout nel vecchio gruppo. Tuttavia, la disfunzione mitocondriale nei topi knockout è stata osservata per la fascia di età giovane, indicata dalla diminuzione dell'efficienza di accoppiamento causata dal knockout di Pink1.
I passaggi critici di questo protocollo includono la preparazione di fette di cervello, il loro trasferimento nella parte superiore dello schermo di acquisizione, il posizionamento di diapositive in pozzetti e il loro fissaggio allo schermo di acquisizione durante le misurazioni.
