Ringraziamo i membri del laboratorio Mariani aiuto la modifica del protocollo. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione di formazione post-dottorato CIRM (JLF), uno stage CIRM BRIDGES (TZTT), E. Robert e maggio R. Wright Foundation (FVM), e la University of Southern California (FVM).

1. Colorazione LysoTracker di embrioni di topo <ol><li> Generazione di embrioni di topo inserendo giovani (5-6 settimana fa) femmine in gabbie prigionieri di sesso maschile. Monitorare il mattino seguente per la comparsa di un tappo vaginale che indica che si è verificato l&#39;accoppiamento. Se la femmina è incinta, a mezzogiorno in quel giorno si chiama 0,5 dpc (giorni dopo il coito). La procedura qui presentata è l&#39;ideale per gli embrioni 7-13 DPC. </li><li> Il giorno embrionale di interesse, l&#39;eutanasia la femmina secondo protocolli approvati e rimuovere l&#39;utero. Rimuovere gli embrioni dalla decidua in una capsula di Petri da 10 cm con Hanks BSS (senza rosso fenolo). Togliere le membrane extra-embrionali e non almeno un risciacquo con Hanks BSS per rimuovere i tessuti estranei e sangue. </li><li> Preparare embrioni Soluzione LysoTracker colorazione (5 mM in LysoTracker Hanks BSS). Un volume utile per 1-2 cucciolate è di 5 ml. Mescolare delicatamente per erogare il colorante in modo uniforme. </li><li> Aggiungi embrioni al Solut colorazione LysoTracker Embryoioni in una provetta per microcentrifuga o flacone e incubare a 37 ° C per 45 min. </li><li> Sciacquare molto delicatamente in Hanks BSS quattro volte, 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Fissare in paraformaldeide al 4% durante la notte. </li><li> Sciacquare una volta in Hanks BSS, 10 min, per rimuovere la correzione. </li><li> Disidratare attraverso una serie di metanolo (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min ciascuna fase) per eliminare la colorazione di fondo. Questo è importante per ottenere un buon rapporto segnale-rumore durante l&#39;imaging. </li><li> A questo punto è possibile memorizzare i campioni di embrioni a tempo indeterminato in metanolo a -20 ° C, al riparo dalla luce. </li></ol> Nota: Un campione di tessuto può essere assunto in qualsiasi fase per la genotipizzazione del DNA, tuttavia, può essere più conveniente prendere un campione prima memoria in modo che fino a questo punto tutti i campioni possono essere elaborazione batch. Raccogliere un campione di tessuto dalla coda, l&#39;incolumità fisica, o la testa da ogni embrione e mettere tutto in tubi separati. Reidratare il campione di tessuto e prepararsi per genotyping. 2. Colorazione LysoTracker di differenziare Culture ES <ol><li> Preparare corpi embrionali via il 15 goccia Metodo con una densità iniziale di 500 cellule per 20 microlitri goccia. </li><li> Dopo 3 giorni, trasferire i corpi embrionali di coltura in sospensione in 10 centimetri non aderenti Petri (cioè quelli utilizzati per il lavoro batteriologica). Cultura per 5 giorni, cambiando i media ogni 2 giorni. </li><li> Il giorno 7, trasferire i corpi embrionali per gelatinizzati 8 pozzetti diapositive camera (aggiungere 0,1% di gelatina alle camere, attendere 5 minuti, togliere e aggiungere media). Trasferimento 1-2 corpi embrionali per ogni camera. </li><li> Cultura per 10 giorni, la sostituzione del supporto a giorni alterni. Attenzione a posizionare la pipetta all&#39;angolo della camera di scorrimento in modo da non perturbare il corpo embryoid fissaggio alla superficie di vetro. Anche quando aggiungendo mezzo fresco anche posizionare la pipetta in un angolo della camera e rilasciare il supporto lentamente. </li><li> Dopo 10 giorni di cultoure, per indurre apoptosi, come controllo positivo, trattano alcuni dei pozzetti con 0,1 mM e 1,0 mM di H 2 O 2 (aggiungere l&#39;H 2 O 2 al fresco supporti, mescolare, quindi aggiungere alle cellule) per 60 min. Lavare due volte con D-PBS e della cultura durante la notte in media regolari. </li><li> Aspirare delicatamente media esistenti e aggiungere cellulare LysoTracker soluzione colorante (500 LysoTracker nM (concentrazione finale) in media, 300 ul per ogni camera). </li><li> Incubare a 37 ° C per 15 min. </li><li> Lavare due volte con D-PBS 2 volte, a 5 minuti ciascuno. </li><li> Fissare in paraformaldeide al 4% per 15 minuti a RT. </li><li> Risciacquare due volte con D-PBS, 5 min. </li></ol> 3. Visualizzazione embrioni Stained LysoTracker o Culture ES <ol><li> Preparare i campioni di cellule per microscopia aspirando la D-PBS, rimuovere la camera dal vetrino, aria di essiccazione per circa 5 minuti, e quindi aggiungendo un mezzo acquoso di montaggio (Vectashield con DAPI o simile). Inserire un foglio di barriera, mentre drying per diminuire sbiancamento del fluoroforo. Montare gli embrioni in una profonda depressione, piatto di vetro o piccola scatola di Petri in Vectashield o simili. </li><li> Visualizza con un microscopio da dissezione o un composto dotato di un rodamina o Texas Red filtro (DND LysoTracker RED-99, di eccitazione / emissione: 577/590 nm). La colorazione è in genere molto luminoso così lunghe esposizioni di solito non sono necessari. </li></ol> 4. Quantificazione dei risultati utilizzando tecniche di imaging <ol><li> Scatta foto digitali dei campioni nelle condizioni di esposizione in modalità manuale. </li><li> Aprire le immagini in Adobe Photoshop o un programma di imaging simile. Per determinare la quantità di colorazione LysoTracker, selezionare il canale rosso e l&#39;immagine di soglia (converte l&#39;immagine in bianco e nero) tale che la colorazione rossa è ora rappresentato da pixel bianchi. Selezionare i pixel bianchi e utilizzare la funzione istogramma per ottenere il conteggio totale. </li><li> Utilizzare il canale blu per contareil numero di nuclei nel campo. Può essere utile per tenere traccia del conteggio annotando l&#39;immagine. </li><li> Registrare i valori e quindi calcolare il livello medio di colorazione per cella. Ripetere questa analisi con l&#39;impostazione stessa soglia per tutte le immagini che si desidera assaggiare. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Vi è un normale modello di PCD durante lo sviluppo embrionale, che può cambiare quando un gene del fattore di crescita, come Sonic hedgehog (Shh), viene rimosso 16,17. Poiché è un colorante LysoTracker piccola molecola che è altamente diffusibile, l&#39;embrione intero può essere visualizzato per valutare le aree di PCD anche in profondità all&#39;interno del mesenchima 12,13 Figura 1 mostra lo schema di colorazione per LysoTracker normali e Shh -. / - Embrioni di topo mutante a 10.5dpc. In questa fase, PCD è notevolmente aumentata in Shh - / - embrioni mutanti, in particolare l&#39;arto e somite regions. Porzioni di l&#39;embrione può essere ripreso per intero il montaggio a maggiore ingrandimento (1B) per valutare la configurazione generale. Porzioni sezionato può anche essere sezionato con un microtomo vibrante (1C) o un criostato (DF) per rivelare regioni PCD in maggiore dettaglio. Analisi TUNEL è fatto meglio su sezioni sottili in cui la penetrazione della transferasi terminale è meno problematica. LysoTracker colorazione e un saggio TUNEL può essere fatto nel tessuto stesso (Figura 1D-G). Questi risultati mostrano che, anche se non c&#39;è una stretta correlazione tra LysoTracker 01:01 e colorazione TUNEL, le regioni generali di sovrapposizione PCD notevolmente. Con un ingrandimento superiore, è possibile vedere che puncta colorazione positiva con il saggio TUNEL, ma non con il colorante LysoTracker, puncta che macchia solo con il colorante LysoTracker, e che sono sovrapposti puncta colorazione. Quando un EB è placcato su una superficie rivestita di gelatina, le cellule si differenziano Migrate verso l&#39;esterno. Dopo 10 giorni di coltura, le cellule si sono differenziate in una varietà di tipi di cellule inclusi neuroni, cellule muscolari, e cardiomiociti. Le culture mostrati in Figura 2 contengono popolazioni miste di questi tipi di cellule, tuttavia si potrebbe migliorare il nostro protocollo per studiare PCD di un particolare tipo cellulare di interesse. Per esempio, la EB potrebbe essere trattata con acido retinoico per migliorare la differenziazione dei neuroni 19, e quindi il saggio LysoTracker potrebbe essere utilizzato per valutare morte neuronale in condizioni diverse. Nella coltura di cellule staminali normali differenziate, ci sono alcune cellule che subiscono PCD e questi possono essere rilevati con LysoTracker e / o saggi TUNEL (Figura 2A). PCD può essere indotta da una serie di diversi agenti citotossici come perossido di idrogeno (H 2 O 2) che induce danno ossidativo e avvia la via apoptotica 20,21. Una bassa dose di H 2 O 2 aumenta siaLysoTracker e colorazione TUNEL rispetto a nessun trattamento, mentre un risultato ad alto dosaggio in restringimento delle cellule e LysoTracker diffusa e positività TUNEL. Simile ai risultati nell&#39;embrione, è possibile vedere che puncta colorazione positiva con il saggio TUNEL, ma non con il colorante LysoTracker, puncta che macchia solo con il colorante LysoTracker, e che sono sovrapposti puncta colorazione. La conseguenza dell&#39;applicazione di un agente citotossico che induce apopotosis viene confrontato condizioni inedia del siero che inducono autofagia (Figura 2D). Le cellule che hanno subito un periodo di inedia del siero (1 ora) presentano un modello diverso in cui LysoTracker e colorazione TUNEL non altamente correlati. LysoTracker colorazione è molto maggiore rispetto alle culture non trattate, tuttavia positività TUNEL è a livelli normali. L&#39;impiego di strumenti standard disponibili in Adobe Photoshop, colorazione LysoTracker può essere quantificata con un metodo soglia sempliceche permette di calcolare il livello medio di colorazione per una popolazione di cellule. Figura 3A-B mostra come una immagine campione appare durante il processo di quantificazione. Partendo con un&#39;immagine di base con colorazione LysoTracker nel canale rosso e il DAPI-tinto nuclei nel canale blu (pannello 3A), il canale rosso di questa immagine è stata thresholded per convertire l&#39;immagine in bianco e nero ed i pixel bianchi erano poi selezionati e contati (Figura 3A &#39;). Un livello di soglia è stato scelto che rappresenta il pattern di colorazione LysoTracker. Come con qualsiasi metodo di quantificazione che utilizza le immagini, è importante evitare di sovraesporre le foto in quanto ciò potrebbe potenzialmente causare un eccessivo accento sulle differenze. Il numero di nuclei nel campo può essere contato guardando solo il canale blu (Figura 3B) e la marcatura dei nuclei utilizzando un attrezzo di disegno come un pennello, mentre il conteggio (Figura 3B &#39;). Si può quindi esprimere °livello di colorazione e calcolando il livello medio di colorazione per cella (numero di pixel / conteggio nuclei). Se si vuole utilizzare questo algoritmo per alta through-put screening, la maggior parte dei pacchetti di screening può misurare la luminosità in un particolare canale e hanno anche una funzione di identificatore di oggetto che conterà nuclei in un campo, tuttavia per le applicazioni più tipiche il metodo manuale è veloce e semplice. Per fare un esempio, una regione campione da figure 2A-C è stata quantificata ed i risultati confermano che aumentare le concentrazioni di H 2 O 2 risultati in un più alto livello di colorazione LysoTracker (Figura 3C). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Colorazione LysoTracker in normali e Shh - embrioni - /. A, A &#39;Normale e Shh -. / - Embrioni di topo a 10,5 dpc, macchiato di rosso LysoTracker, montato in Vectashield e fotografato sottoepiflourescence un microscopio da dissezione. Parentesi indicano la posizione degli arti anteriori B, B &#39;zampa anteriore di normali e Shh -.. / - Embrioni ripreso a maggiore ingrandimento. Nota: i domini normali di morte cellulare compresa la &#39;Zona posteriore necrotico&#39; (contrassegnati da un asterisco) e una regione nel mesenchima prossimale della gemma dell&#39;arto (contrassegnati da una freccia). Arti nulli Shh esporre più forte colorazione nella parte mediale e distale . C, C &#39;. sezioni mediali attraverso la gemma delle gemme degli arti arti anteriori normali e null. Si noti la presenza di colorazione nel mesenchima prossimale (freccia) e AER (punta di freccia) della gemma dell&#39;arto normale e il forte colorazione all&#39;interno del mesenchima dorsale e ventrale e distale all&#39;interno della gemma dell&#39;arto nullo. DF. Nella stessa sezione (12 micron, congelati sezione) è stato ripreso per LysoTracker e colorazione TUNEL (Roche 1684795). La sezione passa attraverso la porzione distale del nulla Shh mesenchyme. I punti di punta di freccia alla AER. Si noti come il modello generale è molto simile con entrambi i metodi, tuttavia la colorazione non si sovrappone completamente. G, G &#39;. Un ingrandimento maggiore dell&#39;ARE e mesenchima, si può vedere sia la presenza di puncta che sono LysoTracker o TUNEL-positive Solo così come puncta che sono sovrapposti colorazione. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Colorazione LysoTracker in cellule ES differenziate. Differenziare le cellule sono state piastrate su vetrini 8-camere in assenza di LIF. Per mostrare come LysoTracker e colorazione TUNEL confrontare, il percorso apoptosi è stata indotta con due diverse dosi di H 2 O 2, mentre la via autofagia è stata indotta utilizzando 1 ora di inedia del siero. Queste immagini sono state scattate con un microscopio confocale Zeiss LSM5 A-A&#39;&#39;:. Colture non trattate mostrare un po &#39;normale apoptosi come indicato da LysoTRacker e colorazione TUNEL. Il modello con entrambe le tecniche per lo più sovrapposizioni (frecce bianche), tuttavia, si può vedere un puncta alcuni che sono LysoTracker (frecce rosse) positivi solo B-B&#39;&#39;, CC &quot;:. Trattamento con quantità crescenti di H 2 O 2 stimola l&#39;apoptosi . La dose più bassa mostra più LysoTracker e TUNEL puncta positivo rispetto alle cellule non trattate. La dose più alta in LysoTracker induce ancora di più e puncta TUNEL positivi. bianco frecce alle macchie sovrapposte, mentre le frecce rosse scegliere puncta che sono positivi per LysoTracker solo. È anche possibile vedere puncta che sono solo positivo per la colorazione TUNEL (frecce verdi) DD &quot;:. inedia del siero può indurre autofagia, che può stimolare un accumulo di materiale in lisosomi e autophagolysosomes. Nota: il numero di puncta LysoTracker più sono visibili rispetto alle culture non trattati. TUNEL positivi puncta sono presenti (la maggior parte dei quali si sovrappongono LysoTracker macchiazione, frecce bianche), tuttavia, il numero non è notevolmente aumentato rispetto a condizioni non trattati. Inoltre, in condizioni di fame siero, LysoTracker solo puncta positivi sono molto diffusi (frecce rosse). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Metodo di quantificazione per valutare il livello di colorazione in una popolazione di cellule utilizzando Adobe Photoshop. A: Una porzione di figura 2A è stato scelto e il LysoTracker (canale rosso) e colorazione DAPI (nuclei, blu canale) è mostrato in questo pannello A &#39;:. Il canale rosso della figura 3A è thresholded per convertirlo in un bianco e immagine in bianco. I pixel bianchi possono essere selezionati e contati utilizzando la funzione istogramma B-B &#39;:. Il canale blu mostra i nuclei e mentre loro conteggio, l&#39;immagine può essere annotati con una funzione di disegno quale un pennello C:. Questo è un exquantificazione ampia di un campione da pannelli 2A-C. I dati sono rappresentati come pixel per nuclei. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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	<li>Baehrecke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+death+shapes+life+during+development.">How death shapes life during development.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).</li><li>Meier, P., Finch, A., Evan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+development.">Apoptosis in development.</a> Nature. 407, 796-801 (2000).</li><li>Ikonomidou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+apoptotic+neurodegeneration+and+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome.</a> Science. 287, 1056-1060 (2000).</li><li>Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+embryonic+cell+populations+to+ethanol-induced+apoptosis:+implications+for+alcohol-related+birth+defects+and+neurodevelopmental+disorder.">Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).</li><li>Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+of+5-FU-treated+fetal+rat+limbs+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+Lysotracker.">Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker.</a> Cytometry A. 53, 9-21 (2003).</li><li>Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development.">Programmed cell death in animal development.</a> Cell. 88, 347-354 (1997).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147, 742-758 (2011).</li><li>Qu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+gene-dependent+clearance+of+apoptotic+cells+during+embryonic+development.">Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development.</a> Cell. 128, 931-946 (2007).</li><li>Grimsley, C., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cues+for+apoptotic+cell+engulfment:+eat-me,+don't+eat-me+and+come-get-me+signals.">Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals.</a> Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Cytometry. 33, 348-354 (1998).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+morphology+in+mouse+embryos+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy.</a> Methods. 18, 473-480 (1999).</li><li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation.">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Chiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+the+limb+prepattern:+limb+development+in+the+absence+of+sonic+hedgehog+function.">Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function.</a> Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).</li><li>Ishibashi, M., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sonic+hedgehog-dependent+signaling+relay+regulates+growth+of+diencephalic+and+mesencephalic+primordia+in+the+early+mouse+embryo.">A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo.</a> Development. 129, 4807-4819 (2002).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Dumont, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+is+CD95-independent,+requires+the+release+of+mitochondria-derived+reactive+oxygen+species+and+the+activation+of+NF-kappaB.">Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB.</a> Oncogene. 18, 747-757 (1999).</li><li>Hampton, M. B., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+caspase+activity+by+hydrogen+peroxide:+implications+for+apoptosis.">Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis.</a> FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).</li><li>Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+engulf+and+clear+apoptotic+footplate+cells+in+macrophageless+PU.1+null+mouse+embryos.">Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos.</a> Development. 127, 5245-5252 (2000).</li><li>Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+autophagy+by+Atg1+inhibits+cell+growth+and+induces+apoptotic+cell+death.">Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death.</a> Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracker+dyes+to+probe+mitochondrial+autophagy+(mitophagy)+in+rat+hepatocytes.">Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes.</a> Autophagy. 2, 39-46 (2006).</li><li>Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+autophagy+visualized+in+live+cells:+from+autophagosome+formation+to+fusion+with+endo/lysosomes.">The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes.</a> Autophagy. 1, 23-36 (2005).</li><li>Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+autophagy+is+related+to+programmed+cell+death+during+the+development+of+the+nervous+system.">How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Caratteristiche importanti della apoptosi comprendono il rilevamento di danno al DNA con il saggio TUNEL, insieme con la rilevazione dell&#39;attività della caspasi (rilevata con anticorpi monoclonali o una molecola legante come ZVAD-fmk), l&#39;osservazione di cambiamenti cellulari, e la presentazione di fosfatidilserina (PS ) sulla superficie della membrana (rilevata da annessina V vincolante). Ci sono alcuni svantaggi con ciascuno di questi saggi. Per esempio, la transferasi terminale utilizzato nel saggio TUNEL non...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td></td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VECTOR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Cellgro </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Cellgro </td><td> 25-000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-mercaptoetanolo, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> Labtek-II Camera diapositive (8 pozzetti) </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1% gelatina </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> PBS di Dulbecco (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzione Ricette Paraformaldeide al 4% Per 100 ml: <ol><li> Mescolare paraformaldeide 4 g, 90 ml H 2 O, e NaOH (una goccia di NaOH 2N). La paraformaldeide non andrà in soluzione fino ad aggiungere un po &#39;di NaOH per aumentare il pH. </li><li> Mescolare e riscaldare a 60 ° C finché tutta la polvere sia in soluzione (~ 10-20 min). Non surriscaldare. </li><li> Aggiungere 10 ml ~ 10x PBS per ottenere un volume finale di 100 ml. </li><li> Conservare a -20 ° C in comoda (~ ~ 10 ml o 40 ml) aliquote. </li></ol> AVVERTENZA: Paraformaldeide in forma &#39;frill&#39; (compresso piccoli pellet) è meno polverosa e può quindi essere misurata al di fuori di un cappuccio. Tuttavia si deve ancora indossare una maschera protettiva antipolvere (N95almeno) durante la movimentazione. EB Cultura Media Per 500 ml EB Media: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404,5 ml </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75,0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutammina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Penicillina / Streptomicina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Sodio piruvato: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol: </td><td> 500pl </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

La morte cellulare programmata (PCD) si verifica negli adulti per mantenere l&#39;omeostasi dei tessuti normali e durante lo sviluppo embrionale di modellare i tessuti e gli organi 1,2,6,7. Durante lo sviluppo, prodotti chimici tossici o alterazioni genetiche possono causare un aumento di PCD o modificare i modelli di PCD con conseguente sviluppo di anomalie e difetti di nascita 3-5. Per comprendere l&#39;eziologia di questi difetti, lo studio di embrioni può essere completata con prove in vitro che utilizzano differenziare staminali embrionali (ES) cellule. L&#39;apoptosi è un ben studiato forma di PCD che coinvolge sia intrinseca ed estrinseca segnalazione per attivare l&#39;enzima caspasi cascata. Alterazioni cellulari caratteristici sono blebbing membrana, restringimento nucleare, e la frammentazione del DNA. Altre forme di PCD non coinvolgono l&#39;attivazione delle caspasi e possono essere il risultato finale di autofagia prolungata. Indipendentemente dal percorso PCD, cellule morenti devono essere rimossi. Negli adulti, le cellule immunitarie perfOrm questa funzione, mentre in embrioni, in cui il sistema immunitario non ha ancora sviluppato, la rimozione avviene con un meccanismo alternativo. Questo meccanismo comporta cellule vicine (chiamati &quot;non professionali fagociti&quot;) assume un ruolo-fagocitica riconoscono il &#39;mangiami&#39; segnale sulla superficie della cellula morente e inghiottire lo 8-10. Dopo immersione, i detriti viene portato lisosomi per la degradazione. Quindi indipendentemente meccanismo PCD, un aumento dell&#39;attività lisosomiale può essere correlata con la morte cellulare aumentata. Per studiare PCD, un test semplice per visualizzare lisosomi nei tessuti spessi e multistrato culture differenziazione può essere utile. Colorante LysoTracker è una molecola altamente solubile piccola che è trattenuto in acidi compartimenti subcellulari come il lisosoma 11-13. Il colorante viene ripreso per diffusione e attraverso la circolazione. Dal momento che la penetrazione non è una, la visualizzazione ostacolo di CPS nei tessuti spessi e multistrato culture è possibile 12,13 </sup&gt;. Al contrario, TUNEL (Terminal deossinucleotidil transferasi dUTP etichettatura fine nick) analisi 14, è limitata a piccoli campioni, sezioni istologiche, e culture monostrato perché la procedura richiede l&#39;inserimento / permeabilità di un terminale transferasi. In contrasto con anilina blu, che si diffonde e si dissolve da solventi, LysoTracker Red ND-99 è risolvibile, luminoso, e stabile. La colorazione può essere visualizzato con un microscopio a fluorescenza o confocale in tutto-mount o sezione utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o solvente 12,13. Qui descriviamo i protocolli che utilizzano questo colorante a guardare la CPS in condizioni normali e Sonic hedgehog embrioni di topo null. Inoltre, dimostriamo analisi di PCD in colture di cellule ES differenziare e presentare un metodo semplice di quantificazione. In sintesi, la colorazione LysoTracker può essere un ottimo complemento ad altri metodi di rilevazione PCD.

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Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Vi presentiamo un protocollo semplice per visualizzare le regioni di morte cellulare programmata (PCD) in embrioni di topo e di differenziazione staminali embrionali (ES) colture cellulari utilizzando un colorante chiamato LysoTracker altamente solubile.

L&#39;uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

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23.0K Views.  University of Southern California. Vi presentiamo un protocollo semplice per visualizzare le regioni di morte cellulare programmata (PCD) in embrioni di topo e di differenziazione staminali embrionali (ES) colture cellulari utilizzando un colorante chiamato LysoTracker altamente solubile.

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Cellule embrionali staminali endoteliali derivati ​​dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole