Uno dei principali limiti della microscopia ad espansione è che la fluorescenza rallenta dopo la polimerizzazione e la digestione. La microscopia ad espansione di ritenzione delle etichette, che chiamiamo LR-ExM, utilizza ancore trifunzionali, che sono in ordine alla polimerizzazione e alla digestione. Dopo aver utilizzato l'ancoraggio trifunzione, introduciamo la fluorescenza dopo la fase di espansione.
Quindi manteniamo un buon rapporto segnale/rumore pur avendo un'alta risoluzione. La microscopia a espansione per la ritenzione delle etichette può essere combinata con qualsiasi altra microscopia a espansione introdotta in precedenza e anche con le microscopie fluorescenti. È molto robusto nel metodo versatile.
E per l'imaging ad alta regolazione, è davvero importante avere un segnale migliorato. Per iniziare, cellule di coltura su un vetro di copertura a camera rimovibile da 16 pozzetti con mezzo completo a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%. Una volta che il conteggio delle cellule raggiunge circa 40.000, fissare le cellule con 100 microlitri di 3,2% PFA in tampone PEM per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi permeabilizzare le cellule con i 100 microlitri di tampone di permeablizzazione a temperatura ambiente per 15 minuti. Incubare le cellule con la soluzione di streptavidina diluita in un tampone bloccante cellulare per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi risciacquare brevemente con 200 microlitri di tampone bloccante cellulare. Successivamente, incubare le cellule con 100 microlitri di soluzione di biotina diluita in un tampone di blocco cellulare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, incubare le cellule con 100 microlitri di soluzione anticorpale primaria contenente anticorpo anti alfa tubulina di ratto e anticorpo a catena pesante anti clatrina di coniglio per 16 ore a quattro gradi Celsius o un'ora a temperatura ambiente. Quindi incubare le cellule con 100 microlitri di soluzione anticorpale secondaria contenente ancore trifunzionali, asini anti coniglio scavare MA e asino anti ratto biotina MA per un'ora a temperatura ambiente. Incubare le cellule con 100 microlitri di glutaraldeide allo 0,25% per 15 minuti a temperatura ambiente per ancorare le proteine all'idrogel.
Rimuovere la struttura superiore della piastra a 16 pozzetti con la lametta o qualsiasi strumento di rimozione preferito e mantenere il vetro del coperchio inferiore. Posizionare il vetro di copertura in una capsula di Petri e metterli sul ghiaccio. Aggiungere 45 microlitri di una soluzione monomerica a ciascun pozzetto per condizionare le cellule.
Incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Per preparare la soluzione di gelificazione, preparare un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Mescolare monomero, acqua bidistillata e 10% T med.
Non aggiungere ancora l'ammonio per solfato. Nel frattempo, tenere il tubo della soluzione di gelificazione sul ghiaccio. Aggiungere il 10% di persolfato di ammonio alla soluzione di gelificazione.
Pipettare immediatamente 40 microlitri di soluzione di gelificazione su ciascun pozzetto mentre si conserva una provetta di soluzione di gelificazione su ghiaccio. Posizionare la piastra del pozzo sul ghiaccio per altri tre minuti. Per mantenere l'umidità del gel durante l'incubazione a 37 gradi Celsius, coprire la piastra di Petri con il coperchio e mettere alcune gocce d'acqua nella capsula di Petri.
Proteggendo il campione dalla luce, spostare il vetro di copertura e la capsula di Petri da 10 centimetri su un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 1,5 ore per la gelificazione. Dopo la gelificazione, tagliare il vetro di copertura per separare ogni gel. Trasferire i gel in sei piastre del pozzetto.
Aggiungere due millilitri di tampone di digestione a ciascun pozzetto. Lasciare i campioni durante la notte a temperatura ambiente o per quattro ore a 37 gradi Celsius. Quindi lavare i gel con almeno 10 volte il volume d'acqua in eccesso rispetto al volume finale del gel ripetendo la fase di lavaggio quattro volte per 20-30 minuti ogni volta e il gel si espande di circa quattro volte in ciascuna dimensione.
Incubare gel in due millilitri di volume di tampone colorante streptavidina digoxigenina con colorante streptavidina da due a cinque micromolari e / o colorante anti digoxigenina per 24 ore a temperatura ambiente mantenendo i campioni al buio. Quindi lavare ed espandere il gel da due a quattro volte con acqua eccessiva. Ogni lavaggio dura da 30 minuti a un'ora.
Per una più facile visualizzazione delle cellule al microscopio fluorescente, colorare le cellule con DAPI durante il terzo lavaggio. Diluire le scorte DAPI in uno a 5.000 deliri in acqua di lavaggio. Incubare il gel con una soluzione DAPI per 30 minuti a un'ora.
Quindi lavare altre due volte con tre millilitri di acqua. Rivestire la camera di imaging inferiore in vetro a sei pozzetti con tre millilitri di polilisina allo 0,01% per immobilizzare i campioni di gel. Quindi trasferire i campioni di gel nella camera di imaging codificata e visualizzare i campioni con qualsiasi oscilloscopio di fluorescenza desiderato.
La microscopia a espansione della ritenzione dell'etichetta mostra una maggiore etichettatura a fluorescenza rispetto alla microscopia a espansione della ritenzione proteica o alla microscopia a espansione della biotina. La microscopia ad espansione della ritenzione dell'etichetta mostra un segnale di fluorescenza circa sei volte superiore rispetto alla microscopia a espansione della ritenzione proteica. LR-ExM può catturare efficacemente piccole strutture, come pozzi rivestiti di clatrina con risoluzione del limite di subdefrazione.
Microtubuli e pozzi rivestiti di clatrina erano coloranti co-immuno che utilizzavano ancoraggi funzionali, scavo NHS MA e biotina NHS MA. Allo stesso modo, i pozzi rivestiti di clatrina e i mitocondri sono stati etichettati utilizzando un approccio enzimatico di tag proteico con ancore trifunzionali, come la biotina BG MA e lo scavo BC MA. Inoltre, l'approccio basato sulla colorazione immunologica e l'approccio enzimatico del tag proteico sono combinati per mostrare la struttura della lamina A / C e del complesso nucleopore.
La microscopia ad espansione di ritenzione dell'etichetta è stata eseguita sul tessuto cerebrale del topo colorando co-immuno il marcatore presinaptico, il fagotto, e il marcatore postsinaptico, Homer 1. Le due etichette erano chiare e ben separate, il che supporta l'alta risoluzione e l'efficienza dell'etichettatura. La microscopia a espansione per la ritenzione del lavoro è un metodo versatile e robusto, che può essere combinato con qualsiasi altra microscopia di espansione introdotta in precedenza.
Per l'imaging ad alta risoluzione, è importante ottenere una buona efficienza di etichettatura per catturare meglio la struttura della scala molecolare. La microscopia a espansione della ritenzione del lavoro è un metodo efficace e robusto per migliorare il segnale.
