Ringraziamo C. Hojer per la lettura critica del manoscritto, B. Bingol (Genentech) per la partecipazione a narrazioni di script, N. Bien-Ly per condividere l&#39;esperienza di una migliore rappresentazione vascolare con l&#39;iniezione coda vena di Lectin colorante, e M Solloway (Genentech ) per i topi utilizzati nell&#39;imaging pancreas. Linea GFP-M è stato creato da J. Sanes (Washington University di St. Louis) e topi CX3CR1-GFP da R. Littman (NYU). Il lavoro è supportato da Genentech, Inc.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con IACUC (Institutional Animal Care ed uso commissione) norme sui topi ~ 3-5 mesi di età. L&#39;autore dichiara interessi finanziari concorrenti. 1. Perfusione animali e Tissue Preparazione Timing: 30-60 min per il mouse + post-fissazione (poche ore a notte). <ol><li> Pesare l&#39;animale e anestetizzare utilizzando ketamina (80-200 mg / kg) e xilazina (7-20 mg / kg) o 2,5% avertin (0,5 ml/25 g di peso corporeo IP). </li><li> Attendere qualche minuto per l&#39;anestesia abbia effetto completo. </li><li> Pizzicare la punta e la coda dell&#39;animale per assicurarsi che l&#39;animale è completamente anestetizzato. </li><li> Perfusione l&#39;animale prima a temperatura ambiente con 0,1 M tampone fosfato (PB) o 0,1 M tampone fosfato salino (PBS) per 5-10 minuti finché il sangue non viene completamente rimosso dal tessuto. </li><li> Passare la perfusione di soluzione fissativa: 4% PFA in 0.1 M PB (o 0,1 M PBS) e proseguire perfusionecon 4% PFA per 30-40 min ad una velocità di 3 ml / min. </li><li> Sezionare l&#39;organo / s di interesse con cura senza danneggiare, ad esempio, evitare la puntura e stringendo il tessuto che viene sezionato. </li><li> Rimuovere il tessuto in più che circonda gli organi (tessuto connettivo, meningi o di materia dura) in una capsula di Petri riempita con PBS. </li><li> Post-fissare gli organi in PFA 4% per alcune ore o durante la notte a 4 ° C. Evitare il lungo post-fissazione, perché PFA potrebbe placare il segnale o aumentare il lavoro straordinario autofluorecense 10 soprattutto per il canale GFP (che è un problema minore nei canali rosso e rosso lontano). </li><li> Lavare gli organi 2-3x con PBS a temperatura ambiente prima di iniziare la procedura di compensazione. </li></ol> 2. Clearing Tissue Timing: 2-3 ore per i piccoli organi e 1-4 giorni per i grandi organi. Note: L&#39;etichettatura fluorescenza dei tessuti da parte espressione del transgene, trasfezione virale, tintura di analisi o di anti-etichettatura corpo dovrebbe essere completata prima della cancellazione. Tutte le fasi di compensazione tessuti vengono eseguite a temperatura ambiente. Le soluzioni di compensazione THF, DBE, Babb (alcool benzilico 1 parte 2 parte benzile benzoato) e diclorometano sono tossiche e per inalazione (condurre esperimenti in cappa adeguatamente ventilati) e il contatto diretto con la pelle deve essere evitato (utilizzare guanti di nitrile). <ol><li> Preparare 50% (vol / vol), 70% e 80% diluizioni THF in acqua distillata in bottiglie di vetro separati come segue: per il 50% THF, ad esempio, miscelare 25 ml di THF e 25 ml di acqua distillata in una bottiglia di vetro con un volume di superare i 50 ml. </li><li> Mescolare le soluzioni agitando delicatamente la bottiglia per un 1-2 min. </li><li> Etichettare la bottiglia di vetro chiaro. </li><li> Chiudere bene le bottiglie e mantenere le soluzioni di lavoro in un armadietto buio. Per ottenere i migliori risultati, non utilizzare le stesse soluzioni di lavoro più lunghi di 1-2 settimane. Pertanto, ordina le soluzioni di compensazione come il più piccolo volume disponibile per essere in grado di utilizzare fresche stock reagenti. </li><li>Riempire i flaconi di vetro (ad esempio, 2-3 ml) con la prima soluzione di compensazione, il 50% THF, e trasferire gli organi da PBS in flaconi di vetro per avviare radura. </li><li> Chiudere bene i flaconi di vetro con i loro coperchi e utilizzare un rotatore (ad esempio, un agitatore ruota) per l&#39;agitazione. </li><li> Utilizzare un foglio di alluminio per coprire e tenere le fiale di vetro nel buio. Avviare il rotatore per mescolare i campioni nei flaconi di vetro per il tempo indicato (Tabella 1) ad una velocità costante (~ 30 rpm). </li><li> Rimuovere la soluzione di compensazione e aggiungere il successivo nel protocollo quando il tempo in Tabella 1 è completato. </li><li> Raccogliere i rifiuti radura in contenitori per rifiuti in vetro che vengono tenuti in una cappa. Ripetere il passaggio precedente per ogni soluzione di compensazione nel protocollo fino alla fine. Usare una pipetta pasteur quando si aggiunge una nuova soluzione di compensazione (ad esempio passando da THF a DBE). </li><li> Al passaggio di compensazione finale con BABB o DBE, i tempi di incubazione possono essere estese o shortened finché i campioni diventano completamente trasparente alla luce visibile (o giallastro / trasparente se è molto grande come tessuto cerebrale). </li><li> Mantenere gli organi eliminato nella soluzione purificazione finale in ogni momento comprendente le fasi di imaging. </li></ol> 3. Preparazione Organi sgomberati per Imaging Timing: 5-15 min. Nota: L&#39;immagine degli organi liquidati non appena una radura completo è raggiunto. A tal fine, seguire i prossimi passaggi per preparare i campioni per la microscopia ottica fogli (ad esempio, ultramicroscopy) o confocale / multi-fotone immagini di microscopia. Nota: gli organi sgomberati perderanno la loro forza fluorescenza nel tempo (soprattutto proteine ​​fluorescenti ad esempio, GFP, etichettatura anticorpo è più resistente e può anche dare risultati migliori con incubazione più lunghi). Per l&#39;imaging, varie tecniche di microscopia a fluorescenza possono essere utilizzati a condizione corretta movimentazione degli organi in CleaSoluzione anello è realizzato. <ol><li> Per la microscopia ottica fogli <ol><li> Posizionare o montare il campione in modo appropriato. </li><li> Fissare l&#39;organo eliminato ruotando manualmente la vite del supporto del campione 4. </li><li> Immergere il campione nella camera di imaging (preferibilmente di vetro) di thelight fogli microscopio che viene riempito con BABB o DBE, se è stato utilizzato nella fase di compensazione finale. </li></ol></li><li> Per più di microscopia fotone / confocale <ol><li> Montare il campione su un vetrino per immagini (o una camera di imaging) con la soluzione di imaging finale per poter un&#39;immagine con un fotone più o microscopia confocale, che utilizzano in genere olio o acqua immersi obiettivi. </li><li> Utilizzare cemento dentale per fare un bordo intorno al tessuto. </li><li> Riempire la piscina con BABB o DBE appena prima di cemento dentale diventa completamente rigida. Nota: Il cemento dentale solidifica rapidamente; praticare un paio di volte per acquisire familiarità con esso prima di provare i campioni reali. </li><li> Porre immediatamenteil campione eliminato nel centro della piscina e coprire con un vetro di copertura. </li><li> Premere il vetro di copertura finché non è completamente sigillato da cemento dentale e tocca la superficie dell&#39;organo eliminato, che consentirà a raggiungere la profondità massima di imaging confocale / microscopia multi-fotone. Note: Questo assicura che nessuna soluzione di compensazione sarà versato durante l&#39;imaging. Evitare immergendo la lente di immagini direttamente nella soluzione di compensazione, che può danneggiare la lente se non è resistente a BABB / DBE o ha una copertura di protezione. </li></ol></li></ol> Organi 4. Imaging sgomberati Timing: 15-45 min. <ol><li> Raccogliere un z-scan che copre l&#39;intero tessuto cancellato (se l&#39;obiettivo utilizzato consente) con la risoluzione migliore che il microscopio in grado di fornire. </li><li> Ingrandite sulle regioni di interesse per raccogliere immagini ad alta risoluzione. </li></ol> 5. Esame dei dati con il software Amira <ol><li> Caricare la serie di immaginis al software Amira con modulo ResolveRT. </li><li> Immettere le dimensioni voxel corrette nella finestra di &quot;Immagine Read Parameter&quot; e premere ok. </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;Multi Planer View&quot; sub-applicazione. Quindi utilizzare il cursore &quot;spessore&quot; per scegliere la soglia ottimale per i valori di grigio, regolando i valori 2D e 3D. </li><li> Visualizza il campione sfogliando le fette in diversi orientamenti 2D e utilizzando il modulo di colture angolo in vista 3D. Nota: Una guida dettagliata risoluzione dei problemi del protocollo può essere trovato in Ertürk et al 4. </li></ol>

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	<li>Tuchin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nat Med. 18, 166-171 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Erturk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+(3DISCO).">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ome+sweet+ome:+what+can+the+genome+tell+us+about+the+connectome.">Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).</li><li>Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+peripheral+corneal+clarity+after+surgical+trauma+in+patients+with+Avellino+corneal+dystrophy.">Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy.</a> Cornea. 25, 497-498 (2006).</li><li>Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bond+strength+and+debonding+characteristics+of+a+new+ceramic+bracket.">Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket.</a> American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).</li><li>Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegenerative+disease.">Microglia in neurodegenerative disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).</li><li>Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Disease:+astrocytes+in+neurodegenerative+disease.+Nature+clinical+practice.">Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice.</a> Neurology. 2, 679-689 (2006).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy.">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pr&#228;paraten. , (1903).</li><li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroinflammatory+response+in+humans+after+traumatic+brain+injury.">The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).</li><li>Zotova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+alterations+in+human+Alzheimer's+disease+following+Abeta42+immunization.">Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).</li><li>Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+cochlear+implantation+in+Friedreich's+ataxia:+A+case+study.">Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study.</a> Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury.">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li><li>Soderblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+fibroblasts+form+the+fibrotic+scar+after+contusive+spinal+cord+injury.">Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury.</a> J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6, 131-133 (2009).</li></ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Metodi Tissue compensazione mirano a ridurre la dispersione di luce di imaging facendo corrispondere gli indici di rifrazione dei diversi strati di tessuto negli organi eliminato. Come risultato, la luce di imaging può penetrare in profondità nei tessuti e stimolare le cellule etichettate / molecole. Questo vecchio concetto di tessuto compensazione 17 ha guadagnato crescente attenzione dopo la prima sofisticata applicazione della tecnica su cervelli intatti topo da Dodt e colleghi 2. Da allora, c&#39;è una lista sempre crescente di nuovi metodi di compensazione tra cui 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY e SeeDB 3,4,7,18-20. In sostanza, tutti mirano a rendere gli organi trasparenti per l&#39;imaging dei tessuti profondi preservando l&#39;etichetta fluorescente. Tra questi, 3DISCO distingue come uno dei metodi più semplici e riproducibili. E &#39;relativamente veloce rispetto ad altri metodi di compensazione di cui sopra (1-5 giorni vs 2-3 settimane per il cervello adulto, rispettivamente) 21. E &#39;già stato successopienamente applicato a diversi organi quali il cervello, il midollo spinale, linfonodi, milza, polmone, tumori solidi, pancreas e ghiandole mammarie 3,4,9. Inoltre, diverse pubblicazioni da parte di gruppi di ricerca indipendenti già usato questo metodo per ottenere risultati di imaging 22,23. Tuttavia, diverse procedure di compensazione tessuto potrebbe essere vantaggioso per condizioni diverse. Per esempio, mentre Sca / e e SeeDB sono applicabili meglio sui tessuti embrionali 6,7, sono i metodi di compensazione a base d&#39;acqua, che potrebbe essere più facile da maneggiare durante l&#39;imaging. Al contrario, la chiarezza è un complicato e costoso metodo di compensazione. Ma può essere vantaggioso nel contesto di etichettatura anticorpo, soprattutto nelle grandi tessuti come cervello 8. La fase più critica per ottenere i migliori risultati di imaging da 3DISCO è l&#39;etichettatura dei tessuti, che si realizza prima la radura tessuto. È essenziale per iniziare con il segnale fluorescente forte possibile. Questo può be realizzato in vari modi, tra cui l&#39;espressione transgenica di proteine ​​fluorescenti, tracciando da coloranti sintetici, trasfezione virale o l&#39;etichettatura degli anticorpi. Va tenuto presente che qualsiasi procedura di compensazione ridurrà il segnale fluorescente dei tessuti. Quindi, se il segnale fluorescente non è abbastanza forte all&#39;inizio - cioè non è facilmente rilevabile prima della compensazione-imaging dei tessuti eliminato fornirà scarsi risultati. Ci sono alcune limitazioni di compensazione metodi che sono in attesa di miglioramenti. Una limitazione importante è che, poiché i reagenti compensazione alterano la struttura degli organi eliminato, non possono essere utilizzati su tessuto vivo. Quindi, esperimenti come con mEos2 fotoattivabile 24 devono essere eseguite prima di fissare e di compensazione. Su di compensazione, super-risoluzione di immagini del segnale fluorescente dalle proteine ​​luminose e fotostabili diventa possibile. Inoltre, poiché il protocollo di compensazione diminuisce l&#39;intensità delle proteine ​​fluorescenti, gli organi eliminato non possono essere conservati per periodi prolungati. E &#39;importante notare che alcuni organi sono più difficili da cancellare. In particolare, se gli organi sezionati conservano grandi quantità di cellule del sangue (per esempio, milza, fegato), sono relativamente difficili da cancellare e di immagine. E &#39;anche relativamente più difficile da raggiungere una compensazione completa per grandi tessuti, come il cervello roditore adulto. Tali tessuti possono avere bisogno di tempi di incubazione più lunghi, che potrebbero, invece, ridurre il segnale fluorescente. Inoltre, lo sviluppo di metodi di microscopia che possa immagini di grandi dimensioni organi trasparenti in una sola volta ad una ad alta risoluzione è un attesa di necessità da affrontare. Un&#39;altra importante limitazione della tecnica è etichettatura tessuto. Mentre un segnale fluorescente forte via di espressione genetica o virus è l&#39;ideale, non ogni cellula o molecola possono essere etichettati geneticamente o virale. D&#39;altra parte, etichettatura anticorpo di tessuti spessi non è una procedura semplice o addirittura non possible nella maggioranza dei casi. Si può avere bisogno di protocolli speciali permeabilizzazione e lunghi tempi di incubazione (diversi giorni a poche settimane) 3. E &#39;anche importante tenere a mente che i tessuti si restringono ~ 20% in ciascuna dimensione (misurata per il tessuto del midollo spinale) dopo aver eliminato principalmente per disidratazione e delipidizzazione. Questa contrazione si verifica ratiometrically e dovrebbe essere corretto in passi di quantificazione. Come osservato nei risultati presentati, strutture fluorescente rimangono intatte, che è l&#39;indicazione di integrità proteine ​​nei tessuti eliminato. A causa della natura idrofoba del tessuto finale eliminato, non può essere ulteriormente trattata con anticorpi o incorporato in soluzioni acquose contenenti ad esempio, Focusclear-che è utilizzato in purezza o 80% glicerolo. Infine, è una sfida per analizzare schiacciante dimensioni dei dati di imaging. Ad esempio, quando un intero cervello murino viene scansionato a una risoluzione cellulare, sarebbe molto difficile rintracciare e quantificare str desideriutture (ad esempio, le reti neuronali o gliali) e confronta su diversi campioni in modo automatico. In sintesi, mentre i ricercatori mirano a scoprire nuovi metodi di compensazione, le diverse sfide di cui sopra (difficoltà di compensazione diversi tessuti, imaging ad alta risoluzione delle aree più grandi, e l&#39;analisi dei dati complicato) dovrebbe essere migliorata in parallelo. In conclusione, recentemente sviluppate tecniche di compensazione dei tessuti tra cui 3DISCO, elegantemente dimostrano che ad alta risoluzione di immagini 3D di organi intatti è ora possibile. Usando questi metodi, scienziati possono ottenere informazioni anatomiche delle cellule e molecole nell&#39;organo intatto. Questi studi pionieristici di imaging 3D su organi trasparenti ispirare un numero crescente di ricercatori di decifrare anatomica complessa e organizzazioni molecolari di tessuti / organi in salute e malattia.

L&#39;esame istologico di tessuti biologici è un approccio fondamentale per comprendere la natura di molecole / cellule nel loro contesto naturale. Idealmente, imaging ad alta risoluzione dell&#39;intero organo è più informativo e desideri. Poiché la luce ha una profondità di penetrazione limitata, a causa della dispersione 1, organi fissi devono essere sezionato al fine di eseguire immagini ad alta risoluzione microscopica. Quindi, la maggior parte degli studi istologici sono realizzate su alcune sezioni di tessuto che costituiscono solo una piccola porzione dell&#39;organo. In alcuni studi, ad esempio, tutti coloro che amano tracciare connessioni neuronali del cervello o del midollo spinale, tutte le sezioni di tessuto da organi bersaglio sono raccolti e ripreso per una ricostruzione in 3D. Tuttavia, sezionamento dei tessuti e la successiva rappresentazione delle singole sezioni ha varie limitazioni. Queste includono la lunga e portando ad una ricostruzione 3D incompleta del tessuto, dovuto a distorsioni meccaniche e difficileies nell&#39;allineamento delle immagini risultanti. Recentemente, di compensazione e di imaging intatti gli organi trasparenti è stato sviluppato come una soluzione significativa per questa lacuna 2,3. Su di compensazione, l&#39;intero organo è reso trasparente che consente alla luce di imaging di viaggiare end-to-end (Figura 1) per produrre immagini ad alta risoluzione dell&#39;organo non sezionato utilizzando un microscopio a scansione laser, come un fotone o la luce fogli microscopio multi ( Figura 2). Vari gruppi di ricerca hanno sviluppato nuovi protocolli di compensazione tessuto poter immagine loro tessuto di interesse per scopi diversi. Questi includono solvente organico 2-5, 6,7 di acqua ed elettroforesi a base di 8 protocolli di compensazione. Tra questi, l&#39;imaging 3-dimensionale di solvente riesce organi o 3DISCO è un protocollo facilmente applicabile su una varietà di campioni biologici compreso il sistema nervoso centrale (SNC) organi, organi immunitarie e tumori solidi. In Additione, può essere combinato con le diverse tecniche di microscopia come foglio leggero microscopia a fluorescenza (LSFM), più fotoni e microscopio confocale a scansione laser. 3DISCO si basa sulla compensazione con reagenti facilmente disponibili e poco costosi come tetraidrofurano (THF) e dibenzil etere (DBE) 4. L&#39;intero protocollo può prendere più breve di 3-4 ore. Così, 3DISCO è una tecnica robusta e veloce rispetto ai metodi istologici tradizionali che possono richiedere settimane o mesi per completare 9.

<table><tbody><tr><td>Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>CX3CR1 GFP mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Littman lab at NYU.</td></tr><tr><td>TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>Used to prepare Avertin solution.</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma</td><td>186562-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma</td><td>270997-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzyl ether</td><td>Sigma</td><td>Sigma, 108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Lectin FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-CC10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0.388888889</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP pharmaceuticals</td><td>504001</td><td>Used in perfusion.</td></tr><tr><td>Glass vials</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Mini Rotator</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Media Storage Bottles</td><td>Kimax Media Bottles</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head</td><td>Gilson, Inc</td><td>F110701 and F117606</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy slide</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>Quantofix Peroxide Test Strips</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira with RT resolve microscopy module</td><td>Visage Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

I neuroni sono altamente polarizzate cellule con morfologia estremamente lungo. La loro funzione dipende dalle connessioni che formano tra loro e con altri tessuti. Quindi, mappando l&#39;organizzazione strutturale dei neuroni è estremamente importante per capire come funzionano in salute e malattia. Tuttavia, tracciando tali enormi connessioni neuronali in tutto il nervoso denominato sistema recentemente connectomics 11 - rimane una delle sfide più difficili nel campo delle neuroscienze. A tal fine, sia UE 12 e USA 13 hanno avviato grandi progetti per mappare il cervello umano. Mentre 3DISCO può essere impiegato in vari organi, è stato particolarmente utile per rintracciare lunghe connessioni neuronali nel midollo spinale e nel cervello. Ad esempio, utilizzando scansioni Ultramicroscopy di ampi segmenti del midollo spinale eliminato, i collegamenti assonale possono essere seguiti nel corso centimetri nel midollo spinale di roditori (Figura 2). In modo simile, l&#39;intero cervello azzerato mouse (Figura 3a) e nell&#39;ippocampo (Figura 3b) possono essere esposte a seguire connessioni neuronali nel cervello. Quando la microscopia confocale fotone o più viene utilizzato sugli organi eliminato, la risoluzione delle immagini può essere notevolmente migliorata, soprattutto in z-dimensione. Per esempio, più fotoni imaging midolli spinali eliminato da topi linea GFP-M (Figura 4a) raggiunge una immagine seamless tutta la profondità (~ 1,5-2 mm) del midollo spinale. Microcopy confocale sul midollo spinale eliminato garantisce una migliore risoluzione in modo simile (figure 4b e c). Multi microscopia Photon Imaging di cervelli eliminato offre immagini ad altissima risoluzione per visualizzare i dettagli fini su strutture neuronali tra cui spine dendritiche (Figura 5). I campioni per 3DISCO possono essere etichettati in vari modi, tra cui l&#39;espressione del transgene, viral trasfezione, colorante tracciamento e l&#39;etichettatura degli anticorpi. Ad esempio, è possibile etichettare l&#39;intero sistema vascolare del cervello (figure 6a e b) e del midollo spinale (figure 6c e d) utilizzando lectine coniugate traccianti fluorescenti 4, che può essere usato per studiare il sangue-cervello-barriera (BBB ), nella salute e nella malattia. Entrambe le microglia e astrociti sono altamente implicati nella patologia della neurodegenerazione comprese le malattie di Alzheimer e le lesioni traumatiche 14,15. Utilizzando 3DISCO, la loro densità e distribuzione nel midollo spinale (Figura 7) o cervello possono essere studiate. Tessuti non neuronali possono anche essere ripreso. Per esempio, cellule Clara nell&#39;intera polmoni roditori possono essere immunolabeled con anticorpi e ripreso senza sezionamento a livello di singola cellula (Figura 8). Analogamente, è possibile cancellare e celle di immagine ad esempiocellule alfa del pancreas tessuto non sezionato (Figura 9). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. 3DISCO compensazione tessuto rende i tessuti non sezionato trasparenti per l&#39;imaging dei tessuti profondi. (A) Uncleared e liquidati (b) i tessuti del midollo spinale come si vede dalla luce visibile. Su di compensazione, profonda scansione laser microscopio il tessuto diventa possibile. (C) i tessuti del midollo spinale Uncleared e liquidati sono stati ripresi al microscopio 2-fotone. Barre di scala in a, b = 0.5 mm ed in c = 100 pm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. 3DISCO imaging midollo spinale a seguire le estensioni assonale. Il midollo spinale sezionato da Thy-1 linea di topi transgenici GFP (GFP-M) è divisa in parti più piccole (~4 mm). Dopo aver seguito il protocollo di compensazione per i piccoli tessuti (Tabella 1) midolli spinali trasparenti sono state visualizzate utilizzando ultramicroscopy. Ricostruzioni 3D di 4 mm segmento ~ midollo spinale in orizzontale (a), coronale (b) e sagittale (c). (D) Rappresentante fatta assoni (rosso) sono mostrati nella vista in scala di grigio trasparente. (E) Vista Alto ingrandimento della regione indicata in (d). Barre di scala in a, b, c, d = 0.5 mm ed in e = 20 micron. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. 3DISCO imaging cerebrale eliminato e ippocampo. Esempi di cervello e dell&#39;ippocampo dei topi GFP-M liquidati sono stati ripresi con una ultramicroscopio. Visualizzazioni 3D dell&#39;intero cervello (a) e ippocampo (b) che dimostrano la GF neuronaleRKS nei tessuti impressi trasparenti. Barre di scala in a = 2 mm e in b = 20 micron. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Tissue compensazione migliora la risoluzione ottenuta da più fotoni e microscopia confocale. Trasparenti segmenti del midollo spinale di topi GFP-M ripresi dal più fotoni (a) o la microscopia confocale (b, c). Si noti che la compensazione sostanzialmente migliora la risoluzione e la profondità delle immagini rivelando la struttura fine degli assoni e dendriti. Barre di scala in un = 100 pm e in b, c = 20 micron. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. 3DISCO immagini delle spine dendritiche. Tessuto cerebrale trasparente da topi GFP-M ripresi dal più fotoni. Visualizzazioni 3D della regione di corteccia cerebrale acquisita presentati in verprospettive (a) ticali e orizzontali (b). (C) ~ 50 micron sporgenza rispetto ai livelli indicati in (a, b). (D) Alto ingrandimento della regione indicata in (c) dimostrare i piccoli dettagli delle strutture neuronali tra cui spine dendritiche (frecce). Barre di scala in un = 50 micron, in b, c = 25 micron, in d = 5 micron. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. 3DISCO di vascolarizzazione. Per etichettare i vasi sanguigni negli organi interi, lectina-FITC colorante è stato utilizzato durante la perfusione (prima della compensazione) come descritto 16. È degno di nota ricordare che abbiamo scoperto che l&#39;iniezione coda vena del tracciante dà il segnale migliore rispetto perfusione cardiaca del tracciante. Dopo aver raccolto i cervelli fissi e midollo spinale, sono stati liquidati e homaged da ultramicroscopy. Visualizzazione 3D dell&#39;intero sistema vascolare cervello di topo in heatmap (a) e scala di grigi (a). (B) visualizzazione 3D della vascolarizzazione di un segmento di midollo spinale di topo in heatmap (c) e scala di grigi (d). Le heatmaps stati generati in base all&#39;intensità di lectina colorazione; blu: bassa intensità (sfondo) e rosso: ad alta intensità (vascolare). Barre di scala in a = 2 mm b = 1 mm, e in c, d = 250 pm. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. 3DISCO delle cellule gliali nel tessuto del sistema nervoso centrale eliminato. Midollo spinale di topi transgenici che esprimono GFP in microglia tgh (CX3CR1-EGFP) o astrociti TGN (hGFAP-ECFP) sono stati liquidati e ripreso al microscopio multi fotone. Rendering 3D di microglia è indicata come volume di visualizzazione superficie (a) e vista trasparente ( <strong&gt; b). (C) Una proiezione ottica (~ 50 micron) viene presentato per visualizzare i dettagli della microglia nel midollo spinale. Rendering 3D di astrociti è mostrata come visualizzazione del volume di superficie (a) e vista trasparente (b). (F) Una proiezione ottica (~ 50 micron) viene presentato per visualizzare i dettagli degli astrociti nel midollo spinale. Barre di scala in a, b, d, e = 100 pm e in C, F = 50 pm. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. 3DISCO di un lobo polmonare tutto il montaggio con anticorpo colorazione di cellule Clara. Per la colorazione anticorpale tutto il montaggio di lobi polmonari, 10 settimane di età topi BALB / C femminili sono stati perfusi attraverso il ventricolo destro con PBS per rimuovere il sangue dai polmoni. I polmoni sono stati successivamente gonfiati con 4% PFA e fissati O / N a RT nel fissativo di almeno tre volte il volume del secoloe tessuto. Il giorno dopo, i polmoni sono stati brevemente sciacquato con PBS e il lobo destro è stato messo in 5 ml di 1% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione per 48 ore o fino a quando il tessuto è affondata. Tutte le colorazioni sono state eseguite in 0,2% Triton X-100 in PBS contenente 5% FBS e 2% BSA e risciacqui erano in 0,2% Triton X-100 in PBS. Colorazione con anti-CC10 è stato per 72 ore a 4 ° C, seguita da ampi lava per circa 6 ore. Marcatura fluorescente dell&#39;anticorpo primario è stato raggiunto con anti-capra-Alexa Fluor-594 anticorpo secondario notte a 4 ° C, seguita da ampi lavaggi per 6 ore a notte. Il giorno seguente, lobi macchiati sono azzerati e 50%, 70% e 80% THF per 30 minuti ciascuno seguito da tre lavaggi in 30 min al 100% THF, seguita da 20 minuti in DCM, seguiti da 30 min in DBE. Barre di scala in una e b = 1 mm e in c = 100 pm. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Figura<html> 9. 3DISCO del pancreas. Dopo la perfusione di topi come sopra descritto nel protocollo, il pancreas è stato dissezionato e cancellato con il protocollo corto. La fluorescenza è derivato da Rosa26 LSL tdTomato ricombinazione indotta da Tamoxifene di topi portatori 200 kb BAC transgene attraversa il glucagone locus endogeno topo con CreERT2 inseriti nella ATG di glucagone. Le frecce indicano alcune delle cellule alfa fluorescenti marcato nel isolotto. Barre di scala in a, b, c = 1 mm e in d = 500 pm. <img alt="Tabella 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tabella 1. Protocolli tessuto di compensazione per i vari tessuti. Esempi di protocolli di compensazione dei tessuti per i diversi tessuti. Si noti che il tempo di compensazione per ogni passaggio può essere ridotto o esteso come necessario per migliorare le prestazioni di compensazione. Il peso approssimativo di piccoli tessuti è ~ 20-100 mg e cervello è ~ 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

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Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.5K Views.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

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Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intatta Caratterizzazione istologica di Microdevices Brain-impiantati e il tessuto circostante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Ricerca

Neuroscienze

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and its associated LNs. The CNS-associated lymphatic system is involved in the drainage of CSF macromolecules and meningeal immune cells toward CNS-draining LNs, thereby regulating waste clearance and immune surveillance within CNS tissues. Presented is a novel approach to obtain three-dimensional (3D) and cellular resolution images of CNS-associated lymphatics while preserving the integrity of their circuits within surrounding tissues. The iDISCO+ protocol is used to immunolabel lymphatic vessels in decalcified and cleared whole mount preparations of the vertebral column that are subsequently imaged with light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The technique reveals the 3D structure of the lymphatic network connecting the meningeal and epidural spaces around the spinal cord to extravertebral lymphatic vessels. Provided are 3D images of the drainage circuits of molecular tracers previously injected into either the CSF via the cisterna magna or the thoracolumbar spinal parenchyma. The iDISCO+/LSFM approach brings unprecedented opportunities to explore the structure and function of the CNS-associated lymphatic system in neurovascular biology, neuroimmunology, brain and vertebral cancer, or vertebral bone and joint biology.

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

A protocol is presented combining tissue clearing with light sheet fluorescence microscopy (LSFM) to obtain three-dimensional and cellular resolution images of the lymphatic vessels and lymph nodes (LNs) collecting the cerebrospinal fluid (CSF) and spinal epidural fluid.

Imaging tridimensionale della vascolatura e del drenaggio linfatico vertebrale utilizzandoiDISCO e microscopia a fluorescenza del foglio di luce

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and ...

Immunologia e infezioni

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Biologia

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...

3D Visualization of Immune Cell Populations in HIV-Infected Tissues via Clearing, Immunostaining, Confocal, and Light Sheet Fluorescence Microscopy

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 million individuals infected worldwide and no widely accessible cure. Despite intensive efforts, a detailed understanding of virus and host cell interactions in tissues during infection and in response to therapy remains incomplete. To address these limitations, water-based tissue clearing techniques CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) and CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) are applied to visualize complex virus host-cell interactions in HIV-infected tissues from animal models and humans using confocal and light sheet fluorescence microscopy. Optical sectioning of intact tissues and image analysis allows rapid reconstruction of spatial information contained within whole tissues and quantification of immune cell populations during infection. These methods are applicable to most tissue sources and diverse biological questions, including infectious disease and cancer.

Tissue clearing, combined with immunofluorescence microscopy, allows spatial visualization and quantification of immune-cell populations and virus proteins within intact tissues. Optical sectioning of cleared tissues with confocal and light sheet fluorescence microscopy can generate 3D models of complex tissue environments and reveal spatial heterogeneity exhibited during HIV infection.

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolli ottimizzati per la pulizia dei tessuti per l'imaging 3D dell'aorta murina

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial wall, including the intima plaque, the media, and the adventitia, which forms the outer connective tissue coat of arteries. Our recent studies have suggested that the adventitia is used by the peripheral nervous system as a conduit for reaching all tissue cells. We also found that the peripheral nervous system, that is, the sensory and sympathetic nervous system, undergoes major remodeling processes involving the neogenesis of axon networks adjacent to atherosclerotic plaques. In this context, understanding the structure of the neural network and its interactions with vascular components of diseased arteries holds major promises for a better understanding of cardiovascular disease pathogenesis. To achieve these objectives, methods to visualize the subcellular architecture of the intact healthy and diseased arteries together with their surrounding perivascular compartments are needed. Tissue clearing allows intact deep-tissue imaging of larger tissue compartments that are otherwise inaccessible. It allows volumetric imaging of intact arteries through the integration of labeling, clearing, advanced microscopic imaging, and image processing tools. Here, we describe two distinct but complementary passive tissue clearing approaches, that is, aqueous-based 2, 2-thiodiethanol (TDE) clearing and solvent-based immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organ (iDISCO) clearing to image isolated aortic segments or whole aorta in-situ in the whole mouse.

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging tridimensionale dei tessuti aortici nell'aterosclerosi

Here, we present optimized tissue-clearing protocols to image the murine aorta in three dimensions (3D). We delineate state-of-the-art procedures for immunostaining, optical clearing, and imaging with the intent to define the anatomical proximity of the peripheral nervous system with atherosclerotic plaques and the adventitia in atherosclerosis.

Imaging tridimensionale dei tessuti aortici nell'aterosclerosi

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial ...