Questo protocollo dimostra un piatto di coltura cellulare microtexture progettato per la crescita di centinaia di organoidi con conoscenza del materiale e pienamente compatibile con la microscopia. La nostra tecnica consente in modo efficiente di generare migliaia di organoidi, pienamente compatibili con l'imaging a lungo termine e la coltura cellulare a lungo termine. Questo protocollo è di forte interesse per applicazioni biomediche come la pipeline di screening dei farmaci e i domini di ricerca sul cancro.
La tecnica presentata in questo protocollo è facile da padroneggiare dopo alcuni tentativi da parte di chiunque abbia esperienza con le procedure di laboratorio e la microscopia ottica. Per iniziare, tagliare piccole porzioni dello stampo PDMS fino alla dimensione richiesta per il dispositivo finale. Tagliarli parallelamente alle direzioni XY dell'array.
Posizionate uno dei dadi dello stampo PDMS preparati a faccia in giù sulla sezione PDMS piatta. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere circa 0,1-0,2 millilitri di adesivo polimerizzabile UV su un lato dello stampo. Seguire la progressione del liquido all'interno della cavità utilizzando un microscopio ottico invertito con ingrandimento 10X.
Esporre l'adesivo alla luce UV per polimerizzarlo. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzando la quantità eccessiva di adesivo su un bordo, tenere l'adesivo polimerizzato sul substrato PDMS piatto premendolo delicatamente con un dito.
Nel frattempo, usando una pinzetta, pizzicare un angolo dello stampo vicino allo stesso bordo che viene tenuto premuto e staccare lentamente lo stampo, assicurandosi che il film strutturato non venga sollevato. Tagliare l'adesivo in eccesso e il substrato PDMS utilizzando una lametta per lasciare lo strato polimerizzato, strutturato e adesivo piatto sul PDMS con il substrato in eccesso su un solo bordo. Trattare un coprislip pulito con un breve processo al plasma di ossigeno per migliorarne l'idrofilia.
Dopo l'attivazione del plasma, rivestire il sottile strato di adesivo polimerizzabile UV posizionando il coprislip sul mandrino sottovuoto di un rivestimento a centrifuga standard e versando una piccola goccia di adesivo al centro del vetrino. Eseguite il processo di rivestimento di rotazione come descritto nel testo manuscritto. Se il rivestimento di rotazione non è disponibile, far cadere circa 0,1 millilitri di adesivo polimerizzabile UV su un coprivetrino pulito utilizzando una pipetta.
Prendi un secondo coprivetrino e posizionalo sopra il primo per far sì che l'adesivo liquido si diffonda uniformemente tra i due vetrini. Una volta che l'adesivo ha raggiunto il bordo dei vetrini, separarli delicatamente facendo scorrere uno sull'altro. Una volta separati, entrambi i coprivetrini saranno completamente rivestiti con un sottile strato di adesivo liquido.
Dopo il rivestimento di rotazione, pre-polimerizzare l'adesivo mediante esposizione ai raggi UV. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV utilizzata. Prendere una delle pellicole testurizzate, metterla a contatto con il coprislip rivestito adesivo. Assicurarsi che il contatto tra l'adesivo parzialmente polimerizzato e il film testurizzato sia il più uniforme possibile.
In questa fase, l'adesivo sul coprivetrino deve essere abbastanza solido da evitare il riflusso e il contatto può essere ottimizzato premendo delicatamente sul vetrino. Esporre i vetrini alla luce UV fino a quando lo strato adesivo rivestito non è completamente polimerizzato. Ciò sigilla il film testurizzato sul coprivetrino e fornisce un isolamento a prova di perdite tra le cavità perimetrali.
Quindi, utilizzando una pinzetta, pizzicare il PDMS sul bordo in cui è stato lasciato il materiale in eccesso dopo il taglio e staccare il substrato piatto PDMS. Questo passaggio consente allo strato di pellicola testurizzata di aderire al coprivetrino con accesso aperto nella parte superiore per la semina delle celle. Prima della semina cellulare, su un dispositivo passivato con copolimero biometrico come descritto nel manoscritto, erogare un millilitro di PBS sterile nelle piastre di Petri di coltura cellulare da 35 millimetri.
Degasare il piatto con PBS sterile utilizzando la camera a vuoto per 10 minuti, seguito da diversi cicli di pipettaggio per rimuovere tutte le bolle. Sostituire il PBS con terreno di coltura sterile e sterilizzare la piastra con luce UV per 30 minuti sotto un cappuccio di coltura cellulare. Preparare una sospensione cellulare seguendo le raccomandazioni di tripsinizzazione o preparazione della sospensione cellulare per le cellule di interesse come descritto nel manoscritto testuale.
Contare e regolare la concentrazione cellulare a 500.000 cellule per millilitro nel terreno di coltura cellulare raccomandato. Rimuovere il tampone PBS dal piatto di coltura cellulare da 35 millimetri e quindi erogare un millilitro della sospensione cellulare regolata. Rimettere il piatto di coltura cellulare nell'incubatore cellulare per 10 minuti.
Circa 80-100 cellule entreranno in ogni cavità perimetrale. Dopo circa 10 minuti di incubazione, recuperare il piatto di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare delicatamente la sospensione cellulare per rimuovere le cellule non intrappolate. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura al piatto di coltura e rimetterlo nell'incubatore cellulare.
Facoltativamente, per recuperare gli organoidi dopo che sono cresciuti nei pozzetti, pizzicare lo strato adesivo testurizzato sul bordo tagliato usando una pinzetta e staccarlo delicatamente dal vetrino, ma tenerlo immerso nel mezzo. L'aumento della concentrazione di copolimero biometrico ha aumentato lo spessore del rivestimento. Il degasaggio completo delle piastre di coltura cellulare era essenziale per rimuovere le bolle d'aria intrappolate nelle cavità perimetrali.
Gli organoidi si sono formati dopo i due giorni e 15 di coltivazione. La microscopia confocale a disco rotante ha mostrato immagini rappresentative degli organoidi e una ricostruzione 3D. Quando si prepara il piatto di coltura, è importante prestare attenzione all'assemblaggio dello stampo o della pila di substrati e garantire un buon contatto tra il film strutturato e il coprifoglio.
Il contenimento fornito dalle nostre micro cavità e l'assenza di perdita di materiale ha attirato l'attenzione dei ricercatori di biologia spaziale interessati a studiare l'effetto della microgravità sull'omeostasi organoide.
