Questo protocollo registra con successo gli effetti dell'aconitina sull'IKv delle cellule H9C2. Promuovere nuove fasi per indagare il meccanismo di cardiotossicità dei farmaci dal punto di vista dei canali ionici. La tecnica patch-clamp a cellule intere è il gold standard della ricerca sui canali ionici con alta sensibilità, alta precisione e alta specificità.
La tecnica patch-clamp dell'intera cellula può essere impiegata per esplorare i meccanismi farmacologici o tossici di canali ionici specifici del juxta gating per malattie multisistemiche, come il sistema cardiovascolare e il sistema nervoso. Per iniziare, digerire le cellule con 0,25% di tripsina per 30 secondi, una volta che il piatto di coltura H9C2 diventa 80% confluente. Coltura 2 volte da 10 a 5 cellule per millilitro con terreno normale o mezzo contenente farmaco in un piatto di 35 millimetri tappezzato con lastre di vetro per 24 ore a 37 gradi Celsius, con un'atmosfera di anidride carbonica del 5% e un'umidità relativa dal 70 all'80%.
Accendere l'estrattore di micropipette e preriscaldare per 30 minuti. Quindi mettere un capillare di vetro borosilicato con un filamento sull'estrattore di micropipette. Selezionare il programma e fare clic su invio sul pannello di controllo.
Fare clic sul programma di rampa nell'angolo in alto a destra per determinare il valore di calore del capillare di vetro. Scrivere il programma per tirare l'elettrodo in base al valore determinato dal test di rampa e fare clic su pull per iniziare a fabbricare le pipette. Accendere il convertitore analogico digitale, l'amplificatore di segnale, il micromanipolatore, il microscopio e la fotocamera.
Aprire l'applicazione di imaging, il software di amplificazione del segnale e il software di acquisizione dati in sequenza. Fare clic su acquisisci e selezionare modifica protocollo nel software di acquisizione dati. Modificate il programma nell'interfaccia della forma d'onda.
Immettere i valori per il primo livello, il livello delta, la prima durata e la durata delta per l'epoca A, l'epoca B e l'epoca C.Quindi fare clic sull'interfaccia della velocità di modalità e impostare i dati della gerarchia di prova. Quindi, fare clic su modifica protocollo per selezionare il pulsante di stimolo e impostare il programma di sottrazione della perdita nella finestra di dialogo di sottrazione della perdita PM. Per stabilire il percorso di archiviazione dei dati, fare clic su file e selezionare impostare i nomi dei file di dati nel software di acquisizione dati.
Quindi aprire il protocollo lKv stabilito selezionando acquisisci e facendo clic su protocollo aperto nel software di acquisizione dati. Infine, fai clic sull'opzione strumenti e seleziona test a membrana per avviare l'esecuzione del protocollo. Aggiungere la soluzione extracellulare al bagno cellulare sull'apparecchio patch-clamp a cellula intera e posizionare il vetrino di copertura verso l'alto con le cellule H9C2 nel bagno.
Riempire il 30% della pipetta con la soluzione extracellulare e installarla sul supporto dell'elettrodo di registrazione integrato nell'apparecchio patch-mors. Stringere la pipetta con il supporto dell'elettrodo di registrazione. Quindi rilasciare la pipetta nella vasca da bagno con il micro manipolatore.
Fare clic sull'interfaccia di offset delle pipette del software dell'amplificatore di segnale per mantenere la linea di base della corrente lKv a zero picoampere. Erogare manualmente una pressione positiva appropriata con una siringa da 1,0 millilitri, collegata al supporto dell'elettrodo di registrazione, attraverso un tubo di plastica. Spostare leggermente la pipetta manipolando il micromanipolatore in tre dimensioni per contattare la cella.
Una volta che la membrana prova l'onda quadra scende da un terzo alla metà dopo che la pipetta tocca la membrana cellulare, rimuovere la pressione positiva e fornire manualmente una pressione negativa appropriata. Quindi fare clic sull'interfaccia patch del software di acquisizione dati per formare il gigaseal. Utilizzare il software di amplificazione a segnale lento di compensazione della capacità e di compensazione della capacità durante il soffitto della cella per compensare la capacità veloce e lenta.
Applicare brevi impulsi di pressione negativa per rompere una zona della membrana cellulare. Eseguire la compensazione della capacità della membrana dell'intera cella facendo clic sul pulsante dell'intera cella del software dell'amplificatore di segnale. Infine, salva e registra i dati, facendo clic sul pulsante di registrazione dei dati.
Aprire i dati lKv salvati con il software di analisi dei dati. Salva le relazioni di tensione corrente. Fare clic su analizza per selezionare le statistiche.
Selezionare l'intervallo come cursori 1 2 per l'analisi dei dati, fare clic sui pulsanti ampiezza di picco e media e quindi fare clic su OK per visualizzare i dati nella pagina dei risultati. Infine, copiare la colonna dei dati medi lKv nel software di disegno delle funzioni per ulteriori analisi. Salvare le tracce correnti rappresentative di lKv.
Fare clic su modifica per selezionare le tracce di trasferimento, quindi selezionare la traccia completa nella regione da trasferire. Quindi, fare clic su seleziona nella selezione della traccia e selezionare IN 0 nei segnali. Infine, fare clic su OK per visualizzare i dati nella pagina dei risultati e copiare i dati totali nel software di disegno della funzione per disegnare le tracce correnti.
Salvare il protocollo lKv. Fare clic su modifica per selezionare crea segnale forma d'onda stimolo e selezionare OK. Quindi ripetere il passaggio per disegnare le tracce correnti senza selezionare il segnale.
L'lKv è stato innescato da 150 millisecondi di stimolo impulsivo depolarizzante da meno 40 a più 60 millivolt a un potenziale di mantenimento di meno 60 millivolt. L'lKv dei cardiomiociti del ratto H9C2, è apparso per la prima volta intorno a meno 20 millivolt, e poi l'ampiezza è aumentata con un'ulteriore depolarizzazione. Rispetto al gruppo di controllo, l'ampiezza di lKv è stata osservabilmente ridotta dopo i cinque minuti di trattamento con 1,5 millimolari 4-AP.
Inoltre, l'lKv è diminuito significativamente ai potenziali di membrana da 10 a 60 millivolt in modo dose-dipendente, dopo il trattamento AC di 24 ore. La singola cellula dopo la registrazione del canale ionico, può essere utilizzata per ulteriori valutazioni omiche a singola cellula, come la genomica a singola cellula, la trascrittomica, la proteomica e la metabolomica.
