Questo metodo utilizza il peptide D DPA, marcato con Gallio-68. Il tracciante radio Gallio-68 per marcare il DPA consente la visualizzazione in tempo reale dell'espressione di PDL-1 in tutto il corpo in modo non invasivo. L'uso del peptide D conferisce al radiotracciante un'iper-resistenza alla degradazione proteolitica e prolunga notevolmente la loro emivita metabolica.
In particolare, la tecnica può essere applicata per valutare diverse patologie, subordinate alla scoperta di bersagli specifici e allo sviluppo di traccianti radio con una buona cinetica di telefonata. La tecnica può essere applicata anche al trattamento di tumori PDL-1 positivi mentre si marca DPA con altri radionucleotidi, come il lutezio-177 e l'attinio-225. A dimostrare la procedura sarà Wu Jiang, un ricercatore del mio laboratorio.
Per la radiomarcatura dell'antagonista del peptide d-dodecapeptide, o DPA, pipettare cinque microlitri del tampone madre preparato contenente DPA in un contenitore di polipropilene da 1,5 millilitri con tappo a vite e aggiungere 400 microlitri di tricloruro di gallio 68 nel contenitore. Agitare la miscela per cinque secondi. Misurare il pH della miscela utilizzando strisce reattive per pH e regolare il pH da 4 a 4,5 con idrossido di sodio molare 0,1.
Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Quindi, seguendo le condizioni menzionate nel testo, sottoporre la miscela di reazione a radioHPLC per analizzare la resa della radiomarcatura. Per testare la stabilità del tracciante nel PBS, aggiungere 10 microlitri di DPA marcato con gallio-68 in soluzione di acetato di sodio a 990 microlitri di PBS.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per una, due e quattro ore, con leggera agitazione. Raccogliere 200 microlitri di soluzione in ogni punto temporale e analizzarla via radio HPLC. Per testare la stabilità del tracciante nel siero di topo, aggiungere 10 microlitri di DPA marcato con gallio-68 in soluzione di acetato di sodio a 90 microlitri di siero di topo appena preparato e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per una, due e quattro ore con leggera agitazione.
Quindi raccogliere 20 microlitri della soluzione in ogni suddetto punto temporale e aggiungere 100 microlitri di miscela di acqua aceto nitrilica nell'aliquota raccolta. Centrifugare la miscela a 5.000 g per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Analizzare il surnatante utilizzando la radioHPLC.
Coltivare le cellule U-87 MG in piastre da 12 pozzetti fino a raggiungere l'80% di confluenza. Quindi rimuovere il terreno e lavare le celle con 0,5 millilitri di PBS. Diluire il DPA marcato con gallio-68 in terreno fresco a una concentrazione di 74 kilobecquerel per millilitro.
Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone DPA diluito marcato con gallio-68 a ciascun pozzetto. Incubare le cellule con DPA marcato con gallio-68 a 37 gradi Celsius per la durata di 10, 30, 40 e 120 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno utilizzando una pipetta e lavare le cellule con 0,5 millilitri di PBS tre volte.
Successivamente, aggiungere 300 microlitri di soluzione molare di idrossido di sodio 0,5 per pozzetto per lisare le cellule. Dopo 30 secondi, raccogliere i lisati di cellule viscose in provette da 1,5 millilitri. Lavare la piastra aggiungendo due volte 0.4 millilitri di PBS per pozzetto e raccogliere la soluzione di lavaggio nei provette da 1.5 millilitri menzionati.
Avviare il computer incorporato del contatore gamma automatico e inserire le provette nel ripiano incorporato. Dopo aver caricato tutti i campioni sul trasportatore, premere il pulsante di avvio. I risultati vengono calcolati nel software interno, mentre la lettura registra i conteggi correlati al decadimento al minuto, o CPM, di ciascuna provetta.
Raccogliere le cellule U-87 MG seguendo il protocollo menzionato nel testo e aspirare le cellule in una siringa da 0,5 millilitri. Successivamente, prendi i topi BALB/c Nude e inietta le cellule per via sottocutanea, mantenendo un conteggio di due tumori per topo. Monitorare la crescita del tumore dopo l'iniezione fino a quando il volume del tumore non è compreso tra 100 e 300 millimetri cubi.
Per eseguire l'imaging PET, iniettare i traccianti per via endovenosa attraverso un catetere della vena caudale preinstallato. Creare un flusso di lavoro di scansione in un computer host utilizzando il software di riferimento, quindi creare una cartella di studio e impostare il protocollo di acquisizione secondo le linee guida del produttore. Esegui scansioni dinamiche su ciascun mouse per 60 minuti in modalità elenco 3D.
Successivamente, definire un protocollo di istogramma e un protocollo di ricostruzione, seguendo le istruzioni del produttore. Usa il filtro di Hanning con un cutoff di Nyquist di 0,5 cicli per pixel per ricostruire immagini dinamiche PET per 25-30 minuti e da 55 a 60 minuti attraverso la retroproiezione filtrata. Genera immagini di proiezione a massima intensità, o MIP, per tutti i mouse.
Somministrare DPA marcato con gallio-68 ai topi Nude U-87 MG portatori di BALB/c attraverso l'iniezione della vena caudale. Dopo l'eutanasia, sezionare la parete toracica dell'animale e aprire il cuore. Utilizzando una siringa da un millilitro, prelevare il sangue e spremere il sangue dalla siringa in una provetta per il dosaggio radioimmunologico, o RIA, che misura 13 millimetri di diametro per il contatore gamma.
Asportare gli organi principali e i tumori e metterli in tubi RIA simili per il contatore gamma. Pesa tutti gli organi principali menzionati nel testo. Misurare la radioattività all'interno degli organi raccolti utilizzando un contatore gamma automatico e correggere i valori di decadimento.
Calcolare la percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto umido. Il DPA marcato con gallio-68 ha mostrato un'elevata impurità di resa radiochimica. Era altamente stabile sia nel PBS che nel siero di topo, non mostrando alcuna decomposizione del gallio-68 o idrolisi peptidica dopo l'incubazione di quattro ore.
Circa il 60% delle cellule U-87 MG è risultato essere programmato per la morte del ligando uno, o PDL-1 positivo mediante citometria a flusso, e la colorazione immunofluorescente ha confermato una forte espressione di PDL-1 nelle cellule U-87 MG. Le cellule U-87 MG hanno mostrato un assorbimento dipendente dal tempo di DPA marcato con gallio-68, che si è ridotto significativamente dopo l'utilizzo di un inibitore PDL-1, BMS-202, come agente bloccante. L'affinità di legame stimata per BMS-202 era di 43,8 nanomoli per litro quando il DPA marcato con gallio-68 è stato utilizzato come concorrente.
Le immagini PET di tutto il corpo hanno rivelato un elevato accumulo di DPA marcato con gallio-68 nel tumore dopo 30 e 60 minuti di iniezione. Un esperimento parallelo ha dimostrato un piccolo accumulo di DPA marcato con gallio-68 nei tumori Bon-1 di controllo negativo a 60 minuti dopo l'iniezione. Inoltre, la colorazione immunoistochimica ha rivelato che le cellule U-87 MG presentavano una considerevole espressione di PDL-1, ma non il tumore Bon-1.
La colorazione con ematossilina ed eosina ha mostrato una morfologia cellulare simile tra i due tessuti tumorali. Lo studio di biodistribuzione ex-vivo ha mostrato una rapida eliminazione della radioattività e del sangue nella maggior parte degli organi analizzati, tra cui cuore, fegato, polmone e muscoli. Il rene ha accumulato la più alta quantità di radioattività, mentre il tumore ha mostrato il secondo più alto assorbimento di traccianti in tutti i punti temporali.
Il fatto che la struttura del peptide D sia diversa utilizzando un metodo efficiente per marcare il DPA con il gallio-68 è il passo più importante. Questa tecnica ha aperto la strada allo sfruttamento del test PET come radiofarmaci efficaci per gestire diversi tumori, sia come traccianti PET che come agenti radiodiagnostici.
