Questo protocollo fornisce un riferimento per l'approccio tecnico allo studio degli autofagi e descrive in dettaglio tutte le procedure sperimentali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'osservazione della lunghezza del cambiamento nel flusso autofagico. Prima di iniziare l'esperimento, determinare l'effettiva concentrazione di infezione e adottare le misure di sicurezza necessarie.
Iniziare centrifugando le cellule miocardiche H9C2 neutralizzate a 179G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e mescolare le cellule nel mezzo completo DMEM soffiando delicatamente. Dividi le celle in nove proporzioni uguali.
Aggiungere dimetilsolfossido al gruppo di controllo. Quindi, aggiungere concentrazioni variabili di crocetina ai gruppi rimanenti. Seminare 100 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.
Una volta incubato per 24 ore, scartare il surnatante. Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere 100 microlitri di terreno basale DMEM a ciascun pozzetto e incubare le cellule per quattro ore a 37 gradi Celsius.
Ora, aggiungere 20 microlitri di MTS e incubare per altre due ore come dimostrato. Infine, misurare l'assorbanza a 490 nanometri e calcolare la vitalità cellulare. Per determinare i ROS, diluire DCFH-DA in rapporto 1:1000 con il mezzo privo di siero.
Scartare il surnatante della cellula da una piastra a 48 pozzetti, precedentemente seminata con cellule H9C2. Quindi, lavare le cellule due volte con un mezzo privo di siero. Aggiungere 150 microlitri di DCFH-DA diluito a ciascun pozzetto e incubarlo a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi, lavare le cellule tre volte con mezzo senza siero. Infine, cattura le immagini usando un microscopio a fluorescenza. Per analizzare il potenziale della membrana mitocondriale, aggiungere la soluzione di lavoro JC-1 alle cellule precedentemente coltivate e mescolare bene.
Incubarli a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, lavare le celle due volte con il tampone colorante JC-1. Aggiungi un mezzo completo a ciascun pozzetto e cattura fotografie utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Fissare le cellule con la soluzione di fissazione cellulare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavarli con PBS una volta. Aggiungere 0,3% Triton-100 a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Dopo due lavaggi PBS, aggiungere la soluzione di lavoro di rilevamento TUNEL a ciascun pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius al buio per 60 minuti. Aggiungere DAPI contenente una compressa di tempra antifluorescenza e acquisire le immagini come dimostrato. Sostituire metà del terreno dalle cellule precedentemente coltivate con terreno fresco in ciascun pozzetto di una piastra da 48 pozzetti.
Aggiungere l'adenovirus mCherry GFP-LC3B seguito da polybrene per migliorare l'efficienza dell'infezione. Sostituire il mezzo ogni 24 ore. Contemporaneamente, utilizzando un microscopio confocale, osservare l'espressione proteica fluorescente per confermare l'infezione.
Una volta infettate, coltivate e catturate le cellule come descritto nel manoscritto. Inizia fissando le cellule precedentemente coltivate con il 4% di paraformaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente e aggiungi lo 0,1% di Tritone-100. Quindi, bloccare le cellule con una soluzione di blocco priva di animali per un'ora.
Quindi, incubarli con un anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere un anticorpo secondario fluorescente alle cellule e incubarle al buio per un'ora. Infine, aggiungere il DAPI contenente compresse di tempra anti-fluorescenza prima di acquisire le immagini.
Nel presente studio, la crocetina ha avuto un significativo effetto proliferativo sulle cellule. Mentre una concentrazione superiore a 200 micromolari ha inibito la proliferazione delle cellule H9C2. La vitalità cellulare è stata ridotta considerevolmente dopo il trattamento con perossido di idrogeno.
Tuttavia, la crocetina ha invertito questo cambiamento in una certa misura. L'aumento del livello di ROS dopo il trattamento con perossido di idrogeno è stato invertito dalla crocetina in una certa misura. I risultati della fluorescenza hanno anche confermato la riduzione dei ROS con crocetina.
Inoltre, l'aggiunta di crocetina ha ripristinato i potenziali collassi della membrana mitocondriale causati dal trattamento con perossido di idrogeno. Allo stesso modo, anche l'apoptosi è stata invertita dalla crocetina. Inoltre, il pretrattamento con crocetina ha invertito il flusso autofagico dei cardiomiociti H9C2, indotto a causa del trattamento con perossido di idrogeno.
Il pretrattamento con crocetina ha anche ridotto la traslocazione dei mitocondri di Parkin indotta dal trattamento con perossido di idrogeno. Seguendo questa procedura, il microscopio elettronico può anche essere utilizzato per osservare direttamente un microfago, consentendo una visione più intuitiva dei mitocondri inghiottiti dagli autofagosomi.
