エッセンシャルオイルのナノハーブカプセル化を使用した抗菌ファブリック

要約

抗菌白衣は、病原体の蓄積や偶発的なバイオスピルの相互汚染を防ぎます。ここでは、ナノハーブカプセル化と修正標準試験を使用して肌に優しい抗菌生地を開発するためのプロトコルについて説明し、白衣の典型的な使用法に対する有効性と適合性を正確に評価します。

要約

白衣は、病原体、こぼれ、火傷への直接暴露を防ぐための保護服として、バイオハザード研究所や医療施設で広く使用されています。これらの綿ベースの保護コートは、その多孔質性、保湿能力、およびユーザーの体からの暖かさの保持により、微生物の増殖と付着部位に理想的な条件を提供します。いくつかの研究は、病院の衣服や白衣上の病原菌の生存を示しており、微生物感染のベクターとして機能します。

これらの問題を解決するための一般的なアプローチは、繊維仕上げに抗菌剤を適用することですが、多くの合成化学物質の毒性と環境への影響のために懸念が提起されています。進行中のパンデミックはまた、効果的な抗菌薬と環境に優しく毒性のない製剤の調査のための窓を開きました。この研究では、キトサンナノ粒子にカプセル化された2つの天然生理活性化合物、カルバクロールとチモールを使用しており、最大4対数の削減(99.99%)で4つのヒト病原体に対する効果的な保護を保証します。これらの病原体は、バイオハザード研究所で使用される白衣で頻繁に検出されます。

処理された布地はまた、90%の微生物減少で最大10回の洗浄サイクルに耐え、これは意図された使用に十分である。白衣使用の典型的なシナリオをより適切に表すために、既存の標準ファブリックテストに変更を加えました。これらの改良により、抗菌白衣の有効性をより正確に評価し、短時間で中和しなければならない偶発的な微生物流出の運命をシミュレーションすることができます。通常の防護コートと比較して、抗菌白衣での病原体の経時的な蓄積を調査するために、さらなる研究が推奨されます。

概要

保護白衣は、微生物学研究所や医療施設で必須の個人用保護具(PPE)アイテムであり、病原体、こぼれ、火傷への直接暴露から保護します。これらの綿のコートは多くの要因のために微生物の増殖を促進します-織物は付着部位と通気を提供し、製造工程で使用される綿と澱粉はユーザーからの剥離した上皮細胞とともに栄養素を供給し、ユーザーへの近さは暖かさと湿気を与えます。繊維製品に微生物が蓄積すると、アレルギーや院内感染、不快な臭い、生地の劣化などの健康上の問題を引き起こす可能性もあります¹。

通常の衣服とは異なり、多くの調査で見られるように、防護コートはめったに洗われたり消毒されたりしません^2,3。多くの研究は、微生物感染の媒介者として作用する白衣の証拠と、医療現場における院内感染のリスクを示しています^2,4、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)などの耐性株³。したがって、それらは微生物汚染から保護することを目的としたPPEの健康上の懸念を引き起こします。バイオセーフティレベル2(BSL-2)施設または微生物学教育ラボの文脈における白衣関連感染症に関する十分な横断的研究はありませんが、多くの規制当局は封じ込めレベル内での白衣の使用を制限しています。しかし、北米の多くの学術機関は、施設内での洗濯や保管などの実際的な制約により要件を満たすのに苦労しており、カフェテリアや図書館などの公共エリアで白衣を着用する事件は一般的です。これらの問題に対する実用的な解決策の1つは、繊維仕上げにおける抗菌剤の適用です。

抗菌生地は、主に体臭を減らすことを目的としたスポーツウェア、アクティブウェア、靴下で人気が高まっています。ただし、これらの生地の使用は、一部の銀コーティングされた綿マスクとヘルスケアウェアを除いて、PPE開発では一般的ではありません⁵。BSL-2ラボで見られる一般的な病原体を抑制し、一般的な病原体の交差汚染から効果的に保護する白衣用の抗菌生地の開発について報告します。

現在、さまざまな抗菌布や仕上げ品が市場に出回っていますが、これらのほとんどは重金属コロイド粒子(銀、銅、亜鉛など)、有機金属、またはトリクロサンや第四級アンモニウム化合物などの合成化学物質を使用しており、環境にやさしくなく¹、皮膚の炎症やアレルギーなどの健康問題を引き起こす可能性があります⁶.一部の合成製剤は、通常の細菌叢や抗菌薬耐性(AMR)の誘導など、非標的微生物が原因で懸念が生じます。米国食品医薬品局(FDA)は、市販の抗菌生地を規制しており、ユーザーに無毒で、生態毒性がないものでなければなりません。したがって、広範囲の微生物を阻害する天然殺生物剤に基づく抗菌布が好ましい。エッセンシャルオイル(EO)は抗菌剤や治療薬として広く使用されていますが、抗菌仕上げでの使用は耐久性のために制限されています^6,7,8。ナノハーブ仕上げ⁸に関する知識と市場調査に基づいて、ハーブベースの抗菌生地は市販されていません。これは、合成コーティングが製造が容易で耐久性が長いためです。研究目的でのみ報告されているいくつかのナノハーブコーティングされたテキスタイルには、ニーム⁷、モリンガ9、およびカレーの葉⁹が含まれます。

本研究では、オレガノEOから抽出された2つの生理活性成分、カルバクロールとチモールを使用し、これらは広範囲の細菌性病原体およびウイルスに対して有効であるが、一般にヒトにとって安全であると認識されている¹⁰。しかしながら、これらの生理活性成分は揮発性であり、したがって、それらの抗菌能力は布地に直接適用された場合、短命である。ナノハーブカプセル化は、生物活性成分または薬物がポリマーシェル内に装填され、コアを環境劣化から保護し、貯蔵寿命を延ばすプロセスです。さらに、一般に10nmから100nmの範囲の小さなサイズのポリマー粒子は、適用の有効性を高め、布地への生理活性化合物の放出を遅らせる。これらの生理活性化合物は、食品保存¹⁰などのさまざまな目的に使用されますが、繊維コーティングには使用されません。

多くのポリマー封止材の中で、キトサンは、非毒性、生分解性、粘膜接着性、生体適合性などの多くの属性により、魅力的な候補です¹¹。それは貝殻および真菌細胞壁に見られるキチンからの脱アセチル化プロセスによって得られる天然多糖類である。薬物またはタンパク質送達11、^12、13、制御放出14^、および抗菌フィルム¹⁰などの生化学的および食品保存用途で使用される。キトサンは水に容易に溶解しませんが、酸性媒体中でコロイド懸濁液を形成します。生理活性分子は、単純な2段階のイオンゲル化法14,15,16によってキトサンナノ粒子(NP)に装填される。このプロセスでは、カルバクロールやチモールなどの疎水性生理活性化合物が水中油型エマルジョンを形成し、界面活性剤Tween 80によって支援されます。続いて、ポリアニオン性化合物であるトリポリリン酸五ナトリウム(TPP)を使用して、ポリカチオン性ポリマー分子に沿ったアミノ基とTPP分子のリン酸基との間の架橋を形成し、複合体を安定化させる。この複合化プロセスは、キトサンのマトリックス内の生理活性化合物を固化させ、その後精製され、綿見本にコーティングされて抗菌生地を生成します。

ナノ製剤は、布地に適用される前に、エマルジョン形態での抗菌効果について最初に試験されなければならない。これは、カービー・バウアーディスク拡散、ウェル拡散、およびシリンダープレートアッセイなどの定性的方法によって簡便に評価することができる。しかしながら、シリンダープレートアッセイ¹⁷ は、様々な体積の製剤をロードし、クリアランスゾーンを比較する柔軟性を提供する。この方法では、抗菌製剤をステンレス鋼のシリンダーに装填し、柔らかい寒天層上に置き、試験微生物または病原体を接種します。試験生物に対して産生されるクリアランスゾーンの直径は、抗菌製剤の阻害能に比例するため、ブロス希釈法の代替として使用できます。ただし、クリアゾーンのサイズは、特定の基準が維持されていない限り、特定のプレート内の比較または定性的尺度にすぎません。抗菌剤は、病原体の増殖を阻害する(生物静性)か、細胞を殺す(殺生物性)ことによって病原体に対して作用し、それぞれ最小発育阻止濃度(MIC)および最小殺菌濃度(MBC)によって定量することができる。しかしながら、生理活性化学物質の有効性および挙動は、布帛¹⁸などの基材上にコーティングした場合とそれらの製剤(液体状態)において異なる。これは、布地への抗菌剤の付着の安定性、含水率、基質の種類、微生物の付着など、複数の要因が有効性に関与しているためです。意図された目的が静菌活性のみである場合、「パラレルストリーク法^」19 などの定性的アッセイは、拡散性抗菌製剤の比較的迅速かつ容易な評価を提供することができます。しかし、殺菌効果を判定する場合は、「繊維材料の抗菌仕上げ評価」²⁰ を採用することで、添加病原菌の対数低減を図ることができます。

プロトコル

1. ナノ粒子の調製

1. ナノハーブカプセル化
   1. 50 mLの1%(v / v)酢酸を準備します。
      注意: 氷酢酸は刺激物であり、重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす可能性があります。全身の白衣、ニトリル手袋、ゴーグルを着用し、ヒュームフードの下で作業します。
   2. 0.6 gのキトサンフレーク(中分子量)を50 mLの1%酢酸(上記で調製)に溶解することにより、キトサン溶液(1.2%w / v)を調製します。室温(R / T)で一晩攪拌(O / N)して、均質なエマルジョンを得ます。
   3. Tween 80を0.5 g加え、60°Cで2時間攪拌(1,000 rpm)して均一な溶液を得ます。生理活性化合物(カルバクロールまたはチモール)を加える前に、溶液をR / Tに持ってきてください。
   4. 0.75 gのカルバクロール(またはチモール)を滴下または徐々に加え、混合物をR / Tで20分間攪拌(1,000 rpm)します。キトサンと生理活性化合物の重量比は1:1.25です。
   5. R / Tで攪拌しながら、50 mL(0.5%w / v)のTPPを混合物に滴下し、30分間攪拌を続け、均一なエマルジョンを得ます。
   6. 同じ手順に従って、生理活性化合物を追加せずにネガティブコントロールを準備します。
2. 浄化
   1. エマルジョンを10,000 × g で4°Cで30分間遠心分離し、上清をデカントした後に形成されたNP(ペレット)を回収します。カプセル化の有効性をテストするために上清を予約します。
   2. 形成されたペレットの体積の2倍のTween 80(1% v / v)を使用して粒子を洗浄し(ステップ1.2.1から)、未結合または遊離の生理活性化合物を除去します。各洗浄ステップで均質な溶液が形成されるまで、ボルテックスによってペレットを乱してください。
   3. 粒子(ステップ1.2.2から)を脱イオン水で2回洗浄して、不純物を取り除きます。
   4. ペレットを(ステップ1.2.3から)30 mLの脱イオン水に再懸濁して、NPを再構成します。NPを4°Cで最大6か月間保管します。
      注: この段階でテストを一時停止できます。
3. 評価
   1. 250〜400 nmの紫外可視(UV-Vis)測定値が範囲内に入るまで、NPを脱イオン水で希釈します(吸光度>1)。
   2. UV-Vis分光光度計を使用して、250〜400nmの範囲の波長にわたってNPのUV-Vis吸収スペクトルを記録します。
   3. NPのアリコート(1 mL)をR / Tで一定期間(1〜6か月など)保管し、新しいサンプルと一緒にシリンダープレート法で抗菌効果をテストします。
4. 布地へのコーティング
   1. パッドドライキュア法^7,21を使用して、綿織物にNPを適用します。
      1. 布地見本を、布製バインダーと混合したNPを含む溶液に浸すまで3分間浸します。次に、見本を2ローラーの実験パダーに通して、余分な液体を取り除きます。
      2. 見本を100°Cで30分間オーブン乾燥し、130°Cで10分間硬化させます。
      3. 最後に、スウォッチを超音波浴で15分間洗浄して、結合していないNPを除去します。
         注: または、以下で説明する簡略化された方法に従ってください。
   2. 綿生地(または白衣見本)を10 cm x 10 cmの正方形にカットします。
   3. カットピースを合成したNP(10%)の2 mLにプラスチック容器(12 cm x 12 cm)にR / Tで2分間浸し、風乾して余分な液体を取り除きます。
   4. 100°Cで3分間加熱プレスしてNPを結合させます。
   5. Tween 80水溶液(2% w/v)ですすいで結合していないNPを取り除き、オーブンで100°Cで30分間乾燥させます。
      注意: この抗菌生地は、R / Tで2年間保存できます。
5. 洗濯耐久性
   1. 生地を50 mm x 50 mmの正方形の見本にカットします。
   2. ガラス/プラスチック容器に入った50mLの温かい水道水(40°C)に見本を入れ、通常の洗剤(非抗菌剤)を2滴加えます。
   3. ロッキングプラットフォームシェーカーまたはマグネチックスターラーで30分間すすぎます。
   4. 風乾するか、60°Cで2時間インキュベートし、抗菌効果をテストします。

2. ナノ粒子スクリーニングのためのシリンダープレートアッセイ

1. メーカーの指示に従って、トリプチカーゼ大豆寒天培地(TSA)、トリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)、抗生物質塩基寒天培地(ABA)、および抗生物質種子寒天培地(ASA)を準備し、121°Cで15psiで15分間オートクレーブ滅菌して培地を滅菌します。
2. 有効性試験が行われる対象の微生物を、新たに調製したTSAプレート(または任意の適切な培地)上で三元ストリークプレート法により継代培養し、インキュベートして純度プレートを製造する。(推奨種: 黄色ブドウ球菌、 大腸菌、 緑膿菌、 およびアルビカンス菌。
3. 新鮮な純度プレートからTSB(10 mLチューブ)の培養物を35°C O/Nで適度に振とう(100-200 rpm)しながら接種します。
4. 溶融ASAを各々の試験管に5.0mL分注する。チューブの数は、試験した微生物の数に対応します。
5. 滅菌済みの溶融ABA20 mLを各ペトリプレート(100 mm x 20 mm)に無菌的に注ぎ、ベース層を形成します。寒天プレートの数は、試験する微生物の数に対応する。メディアが固まるまで待ちます。
6. ベース層が固化した後、ステップ2.3の一晩培養(1.0 mL、35°Cに予温)を各溶融ASAに接種し、直ちに内容物(ASAと培養液の混合物)をABAプレートの表面に移します。プレートを旋回させて、溶融寒天層を均等に分配します。シードレイヤーが滑らかで、隆起や気泡がないことを確認します。
7. 滅菌ピンセットを使用して、寒天プレートごとに最大6本のステンレス製シリンダー(6 mm x 6 mm x 10 mm、オートクレーブ処理済み)を六角形のパターンに等間隔に配置します(図1)。
8. 抗菌効果をスクリーニングするために、異なる容量(30 μL、50 μL、75 μL、および100 μL)の合成NPをシリンダーにロードします。ネガティブコントロールは、生理活性化合物を含まないものです。
9. 一般的な細菌性病原体( 大腸菌、 黄色ブドウ球菌、緑 膿菌など)を35°Cで24時間、真菌種( アルビカンス菌など)をR/Tで3日間インキュベートします。
10. クリアゾーンの直径を測定し、合成されたNPの有効性を比較します。
    注意: このテストは、ファブリックにコーティングするのに最適なNPを事前にスクリーニングするために使用できます。

3.パラレルストリーク法(AATCC 147から変更)

1. 材料の準備
   1. NP処理された生地を50 mm x 25 mmの見本にカットします。
   2. メーカーの指示に従ってミューラーヒントン寒天培地(MHA)、TSA、およびTSBを準備し、121°C、15psiで15分間オートクレーブ滅菌して培地を滅菌します。
   3. 有効性試験が行われる目的の微生物を、3ウェイストリークプレート法によって新たに調製したTSAプレート(または任意の適切な培地)で継代培養し、細菌染色の場合は35°Cで2日間、真菌株の場合はR / Tで5日間インキュベートして純度プレートを生成します。(推奨種: 黄色ブドウ球菌、 大腸菌、 緑膿菌、 およびアルビカンス菌。
2. 微生物培養のスパイク
   1. 新鮮な純度プレートからTSB(10 mLチューブ)の培養物を35°C O/Nで適度に振とう(100-200 rpm)しながら接種します。
   2. O / N培養物を1.5 ×^{10 8} コロニー形成単位(CFU)/ mLに希釈するか、0.5マクファーランド標準(ほとんどの健康な培養物では通常1/10から1/20希釈)の濁度に対応します。
   3. 上記の希釈培養液を以下のように4 mm滅菌ループを用いて接種する。 図2に従って、ループ状のブロス培養液をロードし、それぞれ長さ6 cm、間隔1 cmの5本の平行なストリークを作成してMHA寒天プレートの表面に移します。ループを補充しないでください。
   4. 滅菌ヘラを使用して布見本を5本の縞をそっと押し、布が中央にくるようにし、5本の縞線すべてに接触させます。35°Cで24時間インキュベートします。
3. 抗菌効果の定性的評価
   1. インキュベートされたプレートを調べて、布の端を越えた縞に沿った成長の中断を調べます(クリアゾーンは成長の阻害を示します)。
   2. 式 (1) を使用して、ファブリック見本の両側のストリークライン(W)に沿った抑制ゾーンの平均幅を計算します。
      W = (T - D)/2 (1)
      W =クリアゾーンの幅。T =スウォッチ幅を含むクリアゾーンの全長。D =ファブリック見本の幅(25 mm)。

4. 定量的対数削減法(AATCC 100から変更)

1. 実験準備
   1. 生地を50 mm x 50 mmの正方形の見本にカットします。
   2. メーカーの指示に従ってTSA、TSB、Letheenブロス、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製し、オートクレーブ滅菌によって培地を滅菌します。
   3. 純度プレートから単離されたコロニーを滅菌TSBに接種し、35°Cで18〜24時間インキュベートすることにより、有効性試験が行われる目的の微生物のO/N培養を準備します(推奨種: 黄色ブドウ球菌、大腸 菌、緑 膿菌、 およびC.アルビカンス)。
2. 微生物培養のスパイク
   1. O / N培養物を1.5 × 10⁸ CFU / mLに希釈するか、0.5マクファーランド標準の濁度に対応します(通常、ほとんどの健康な培養物では1 / 10〜1 / 20希釈)。
   2. 以下のように布帛の液体保持能力を測定することにより、スパイクする培養液の適切な量を決定する。
      1. 一連の量の希釈ブロス培養液(100〜500μLなど)を布見本(別々のペトリプレート内)に追加し、布見本が水を完全に吸収し、残留/遊離液体を残さないように容量を選択します。液体保持能力は、生地の種類や厚さによって異なります。通常の綿白衣の場合、約200μLです。
      2. 各培養液の容量(上記で決定した液体保持能力[200μLなど])を、滅菌ペトリプレートに入れた見本にスパイクします。見本の数は、テストの数(たとえば、洗濯直後および洗濯後にテストされた生地[およびテストされた洗濯サイクル])、および接触時間にわたってテストされた抗菌効果(たとえば、30分、2時間、1〜3日目])に対応します。
         注:エアゾールフィルターチップ付きのマイクロピペットを使用して(その後の使用でピペットが汚染されるのを防ぐため)、スウォッチに培養液を均等に接種します。
      3. ネガティブコントロールには、同じタイプの未処理の生地見本を使用します。対応する各試験微生物種、接触期間、異なる布地、および洗浄サイクルについて陰性対照を実行します。
3. 生残プレート数による微生物の回収
   1. 接種されたスウォッチ(処理済みと未処理の両方)を、テストするために必要な接触期間(たとえば、0分、30分、60分など、または長期的な効果の場合は数日)R / Tでペトリプレート(蓋を半開き)内で風乾させます。即効性と中和効果を表すために、常に「0分」を含めます。
   2. スウォッチを無菌的に移して滅菌遠心チューブ(50 mL)を分離し、キャップをしっかりとねじ込みます。
   3. Letheenブロス(関連する中和バッファー)を加えて、1/100希釈します(例:.、200 μLの接種材料に対して19.8 mL)。
   4. スクリューキャップで遠心管をしっかりと閉じ、中速で1分間ボルテックスします。
   5. その後の1/10希釈で滅菌PBSで懸濁液を連続的に希釈し、「未処理」群のコロニー数がカウントするには低すぎるようにします(TLTC)。
   6. 希釈液(0.1 mL)を、微生物の増殖をサポートする適切な培地プレート(細菌の場合はTSAや真菌の場合はサブローデキストロース寒天培地[SDA]など)または増殖を最適化し、良好なコントラストを提供してコロニーカウントを正確にする培地にプレートします。
   7. 細菌プレートを35°Cで2日間インキュベートし、真菌プレートをR/Tで5日間インキュベートします。
   8. コロニーカウンターまたはイメージングソフトウェア(CFU AIなど)を使用して、実行可能なCFUを直接カウントします。
   9. 式(2)を使用して、抗菌布による微生物対数の減少(R)を計算します。
      R = × 100 (2)
      A = 未処理のファブリックから回収されたCFUの数のログ値。B = 処理済みファブリックから回収されたCFUの数のログ値。

結果

合成されたNPの初期スクリーニング
2段階の水中油型乳化技術¹⁶に続いて、生理活性化合物(カルバクロールおよびチモール)がキトサンに首尾よくカプセル化された。これは、生物活性化合物を含まないキトサンNPであった対照と比較したそれぞれの生理活性化合物のピーク吸収についてUV-Vis分光光度法によって確認された。構成されたNPは、4°Cで12ヶ月間にわ?...

ディスカッション

殺生物剤の抗菌効果は、細菌を抗菌液に24時間浸漬する最小発育阻止濃度(MIC)や最小殺菌濃度(MBC)などの定量的アッセイによって従来テストされています。ただし、これらのアッセイは、液体界面が不足しており、殺生物剤が布繊維に沿ってゆっくりと拡散するコーティングされた布地には適していません。そのため、AATCC 147、ISO 20645、AATCC 100、JIS L 1902など、多くの標準ファブリックテストが...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Millipore Sigma	64-19-7
Antibiotic base agar	BD Difco	DF0270-17-4	Also known as Antibiotic Medium 2
Antibiotic seed agar	BD Difco	DF0263-17-3	Also known as Antibiotic Medium 1
Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood)	Donated by CFIA
Bromcresol Purple Lactose Agar	Donated by CFIA
Candida albicans	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 10231
Carvacrol	Millipore Sigma	282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter	Model # X-22R	Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time.
Chitosan Medium Molecular Weight (CS)	Millipore Sigma	448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press	Intiva	IM1200
Escherichia coli (E. coli)	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 23725
Incubator	Thermo Scientific	1205M34
Letheen Broth	BD Difco	DF0681-17-7	Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product.
Milli Q water	Millipore Sigma	ZR0Q16WW	Deionized water
Mueller-Hinton Agar	BD Difco	DF0252-17-6
Pentasodium tripolyphosphate (TPP)	Millipore Sigma	238503 (CAS# 7758-29-4)
Phospahte Buffered Saline (PBS)	Thermo Scientific	AM9624
Pseudomonas aeruginosa	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar	BD Difco	DF0109-17-1
Shaking incubator/ Thermo shaker	VWR	Model# SHKA2000
Staphylococcus aureus	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 6538
Thymol	Millipore Sigma	T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar	BD Difco	236950
Trypticase Soy Broth	BD Difco	215235
Tween 80	Millipore Sigma	STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrophometer	Thermo Scientific	GENESYS 30 (840-277000)