抗菌スクリーニングモデルとしてのGalleria mellonella

要約

この研究は、前臨床抗菌評価で使用するために G.mellonella 感染モデルを最適化するための標準化されたフレームワークを示しています。 G. mellonella モデルを前臨床抗菌薬開発パイプラインの一部として適用することで、臨床試験に進む効果のない化合物の数を減らすことができるかもしれません。

要約

世界的に高まる抗生物質耐性の問題に立ち向かうためには、新規抗菌薬の開発を加速させることが不可欠です。現在の前臨床抗菌薬開発では、臨床試験前または臨床試験中に不適切であることが証明されたリードが相当数得られています。前臨床開発の効率を高めるためには、関連性があり、標準化され、アクセスしやすく、費用対効果の高いモデルを開発する必要があります。 Galleria mellonella (オオガロガ)の幼虫は、微生物の病原性を評価するための感染モデルとして広く使用されており、薬物毒性試験を実施し、新規抗菌化合物の 生体内 有効性を評価する予備的な手段として機能します。これらの感染モデルは、同等のスループットを持つ多くのin vitroスクリーニングよりも生物学的関連性が高く、抗菌試験のプレスクリーニングとして使用すると、哺乳類モデルへの依存度が低下します。このプロトコルは、 G. mellonella 感染モデルの最適化のための標準化された方法論を説明しています。これは、細菌種や選択した抗菌治療薬に適用できます。WHOの優先病原体である 緑膿菌 を例に、再現性のある感染モデルと治療的検査を開発するために実行できる手順を概説します。これには、実験のセットアップ、サンプル調製、感染および治療プロトコルに関する推奨事項が含まれます。このモデルを前臨床抗菌薬開発パイプラインに統合することで、哺乳類モデルへの依存度が減少し、臨床試験に到達する効果のない化合物の数が減り、最終的には前臨床抗菌薬開発の効率が向上します。

概要

Galleria mellonella(オオオカゲ)の幼虫は、微生物種の感染モデルとして、また新規薬物化合物の毒性試験として、生物科学全体で広く使用されています^1,2。これらは、ハイスループットであり、ヒト感染の不可欠なin vivo特性を再現し、研究における哺乳類種の倫理的使用を規定する削減、改良、および置換の原則に沿って哺乳類モデルへの依存を減らすため、前臨床抗菌試験パイプラインでかなりの有用性を持つ可能性があります。

新しい抗菌薬の開発には、臨床検証に先立って、 in vitro および in vivo モデルで広範な前臨床試験を行う必要があります³。有望な前臨床データパッケージを持つ新規薬剤はごくわずかで、この高い離脱率の1つは、感染環境の複雑さを捉えるための前臨床スクリーニングの失敗です⁴。これらの問題は、臨床への抗菌薬の翻訳率が低いだけでなく、後期前臨床スクリーニングにおける実験脊椎動物の使用の増加にも寄与しています。新規抗菌薬の前臨床評価を改善し、高価で時間がかかり、複雑で倫理的に問題のあるマウス のin vivo モデルの使用を減らすためには、脊椎動物系での試験に進む見込みのない化合物の数を減らす、より優れた初期段階の薬物スクリーニングツールが必要です。

G. mellonellaは、卵、幼虫、蛹、成虫の4つの生活段階からなる8週間の短いライフサイクルを有し、そのうちの幼虫の形態は、このプロトコル¹で利用されています。G. mellonellaは、専門の機器や専用の動物研究施設を必要とせずに、実験全体を通して簡単にメンテナンスできます。それらの使用について倫理的承認を求める必要はなく、研究者は実験品質を改善するために生物を社内で繁殖させることができます2,5,6,7。G. mellonellaの免疫系は、哺乳類の自然免疫系と非常によく似ており、「自己」および「非自己」の刺激に応答する能力を持っています⁸。血球は、病原体に関連する分子パターン認識とその後の食作用に関与しており、ヒトの好中球と機能的に類似した役割を果たしています⁹。G. mellonellaは、配列によってヒトとの相同性によって同定された3種類のToll様受容体をコードし、非自己物質を認識し、フェノロキシダーゼのメラニン¹⁰への活性化および重合に続いて局在するメラニン化複合体を形成する補体様タンパク質を産生します。これは、感染実験中にキューティクルがメラニン化によって暗くなるため、幼虫の健康状態を視覚的に読み取るのに役立ちます。ただし、フェノールオキシダーゼを含む昆虫のメラニン化軸は、哺乳類のチロシナーゼ-メラニン軸とは大きく異なることに留意すべき^{である11,12}。さらに、G. mellonellaは、リゾチームやディフェンシンホモログ¹³を含む18の誘導性抗菌ペプチドを産生する。この類似性に加えて、モデルの単純な幼虫の維持手順と高スループットの性質により、G. mellonella は新薬の評価に広く利用される生物となっています。前臨床抗生物質の開発において、G. mellonellaは、能動免疫を持つ複雑な環境での宿主-病原-薬物相互作用をより正確にモデル化できるため、in vitroモデルと比較して有用性が向上しています。

現在、ヨーロッパにはG.mellonellaの標準化された研究グレードのサプライヤーはありません。研究者は代わりに、餌屋からG.mellonellaの幼虫を購入するか、独自のコロニーを維持する必要があります。G. mellonellaのコロニーを社内で維持する方法が説明されており、実験の一貫性を高めることができます^5,6,7、^この選択肢は、幼虫を頻繁に使用する人々にとってのみ魅力的である可能性があります。そのため、このプロトコルは、生き餌の供給者から幼虫を購入した後の実験設定に焦点を当てています。この方法は、よりアクセスしやすい一方で、実験の複雑さを増し、サプライヤーから幼虫を受け取る時点での幼虫の健康状態に一貫性がないため、アッセイに追加のばらつきをもたらす可能性があります。学術界、産業界、規制当局がG.メロネラ試験を前臨床抗菌薬開発パイプラインの一部として受け入れ、採用するためには、抗菌薬の有効性の最適化と評価のための標準化されたシステムが必要です。

この研究は、抗生物質開発のためのG.mellonella感染モデルの実験デザインを最適化します。G. mellonella感染モデルが記載されているが^14,15、本方法論は、供給の不一致によってもたらされる追加の複雑さを軽減するための追加のステップを文書化し、新規抗菌薬の評価のためのフレームワークを提供する。テストケースとして、G. mellonellaをWHO優先1の病原体である緑膿菌に感染させ、アミノグリコシド剤(トブラマイシン)による治療を最適化しました。図1に示すこのフレームワークは、新規薬剤を用いた将来の前臨床抗菌スクリーニング研究の基盤となります。

プロトコル

この研究では、 Galleria mellonella (オオオカゲ)の幼虫を抗生物質感受性試験および急性毒性試験のモデルとして選択しました。 Galleria mellonellaの実験的使用に倫理的承認は必要ありません。.使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 実験計画法

1. 研究が捕捉することを目指している幼虫の生存率の比例的な変化に基づいて、適切な Galleria mellonella 幼虫グループサイズを決定します。 表1 は、 緑膿菌PAO1 感染モデルを用いて生存率の特定の割合の変化を検出するために必要なグループサイズを詳述している。
   注:新規病原体を使用する場合は、まず、感染したが未治療の幼虫の比例生存率のアッセイ間変動性を決定します。
   1. PBSコントロールには、シリンジが鋭利で使用に適していることを確認するために残りの感染前に注射するグループと、細菌感染中または感染後に注射して感染グループ間の適切な滅菌を確保するための2つのグループを含めます。新しい病原体で最適化する場合は、異物に対する免疫反応による死亡ではないことを確認するために、加熱処理されたコントロールを含めます。
      注:インスリン注射器は注射に使用できるため、鈍化や汚染のリスクが軽減されます。しかし、実験では日常的に数百種類の G.メロネラ菌が使用されるため、インスリン注射器の使用は高価で無駄になります。
   2. 抗菌治療を最適化する研究では、細菌に感染したグループとビヒクルの「偽」治療を注射するグループ、ビヒクルを2回注射するグループ(感染時に1回は他の条件に、1回は治療時に)の2つのコントロールを追加します。
      注:前者は未治療のコントロールであり、後者は注射によって引き起こされたトラウマを制御します。このような外傷は、鈍い針を使用するとより可能性が高くなります。
2. G.メロネラを生き餌の供給業者に注文するか、前述の^5,6,7のようにG.メロネラのコロニーを維持します。材料表に記載されているサプライヤーは、サイズに基づいて約33%が除外され、さらに10%がキューティクル滅菌後に死亡する可能性があるため、予定された幼虫の数の1.8倍を注文してください。
   1. 実験に使用する前に G.mellonella の重量変動性を判断し、重量範囲が平均の1標準偏差を超えないようにしてください。
      注意: 材料表に記載されていないサプライヤーの場合は、サプライヤーに新しい在庫を提供するように手配してください。
3. 受領後、 G. mellonella を室温で保存して、37°Cでのインキュベーション後に発生する繭化の可能性を制限してください。
   注:商業供給業者からのすべての幼虫が繭を形成するわけではなく、これは以前に幼虫の健康の指標として使用されてきました¹⁶。
4. 幼虫は受領後1週間以内に使用してください、その場合、彼らは給餌を必要としません。
   注:幼虫のライフステージはバッチによって異なりますが、ほとんどの幼虫は蛹になる前の最後の幼虫に出産されます。この段階では、摂食は前の段階と比較して自然に減少します¹⁷。

2. G. mellonella 幼虫の滅菌と選抜

1. Galleria mellonellaの幼虫の体重を量り、幼虫の平均重量である224 mg±49.2 mgの範囲外にあるものは捨てます。これにより、幼虫の約33%が除外されます。
   注:重量のばらつきはサプライヤーによって異なる場合があります。このプロトコルに記載されていない供給業者については、適切な重量範囲を計算してください。
2. アセプティック条件下で次の手順を実行します。
3. 70%エタノールをシャーレにスプレーし、ディッシュの底を覆うのに十分な量を確保します。
4. G. mellonellaの表面を10〜20匹の幼虫のバッチで滅菌します。
   1. 各バッチを個別に皿に入れ、幼虫に70%エタノールを2回スプレーします。
   2. ピンセットを使用して幼虫を転がし、完全にカバーします。
   3. エタノールから幼虫を取り出し、滅菌済みのペトリ皿に入れます。幼虫を乾かすために、皿を蓋をせずにおいてください。
      注意: G.mellonella をエタノールに15秒以上放置すると、死亡率が高くなります。
5. 幼虫の約90%が2時間後に活動を再開したら、回収した幼虫を 、表1に詳述されている検出力の計算に従って生存変化を十分に検出できるサイズのグループに分けます。
6. G. mellonellaは滅菌後6時間以内に使用してください。

3. 細菌の接種密度の最適化

1. 感染前に既知のCFU/mLの細菌感染ストックを調製します。ストックの生成方法は生物によって異なります。ここでは、 緑膿菌を 栄養ブロス中で中対数期まで増殖させ、分注し、6 x 10⁷ CFU/mLの密度で凍結しました。
2. 感染ストックを10,000 x g 、室温で5分間遠心分離してペレット化し、PBSに再懸濁します。各幼虫に10μLの接種材料が注射されることを考慮して、幼虫あたり10^{1-10 7} CFUの範囲の接種量を生成するために、細菌ストックを10倍に連続希釈します。
   注:特定の接種範囲は細菌の病原性によって異なりますが、ここで提案されている範囲はほとんどの病原性種に適しているはずです。 In vitro の成長率の決定は、液体培養における菌株特異的な成長率が幼虫の死亡率と相関しているため、適切な用量範囲の選択に役立つ可能性があります。
3. 感染を開始する前に、MilesおよびMisra段階希釈で接種物を列挙し、接種物密度¹⁸を正確に決定します。
4. 滅菌dH₂O、70%エタノール、または滅菌PBSのいずれかを含む3本の1 mLマイクロチューブを調製します。これらは、幼虫を注入するために使用される注射器を滅菌するために継続的に使用されます。
5. 滅菌済みの100μLハミルトンシリンジを検査し、針先が鋭利で、感染部位に重大な外傷を引き起こすフックが発生していないことを確認します。
   注意: ハミルトンシリンジの針先は、約300回の感染後に反り始めます。針先がゆがんでいる場合は、交換する必要があります。
6. 感染する前に、シリンジをdH₂O、エタノール、およびPBSで順次洗浄し、シリンジの最大容量を引き出して廃棄します。
7. 再懸濁した感染接種物をボルテックスし、ハミルトンシリンジに最大100μLを吸い上げ、幼虫あたり10μLを注入するのに十分です。
8. 各幼虫に10μLの接種物を右後部前脚に注入します。針が体内に約2mm貫通していることを確認します。
   注:さまざまな感染方法を使用できます。これらには、幼虫をピペットの先端にかざして前脚を露出させる、シリンジを静的に固定して G.mellonella を手で位置決めする、またはフリーハンドで注射することが含まれます。
9. 感染の各セットの間に、ステップ2.5で詳述されているようにシリンジを滅菌して、残留皮膚の共生による汚染を防ぎます。.
10. 感染した幼虫を、微生物の増殖に十分な温度、20°Cから42°C(G. mellonellaの生存に適した範囲)でインキュベート^{します5。}
11. G. mellonellaの生存を、通常最初に死亡が観察される時点から定期的にモニタリングし、死亡時間を正確に測定します。これは、第一画面で評価する必要があります。死んだ幼虫をすべて取り除き、死亡時刻を記録します。
12. 18時間までに50%の死亡率、72時間までに80%を超える死亡率をもたらす用量に基づいて、治療試験研究に最適な感染用量を選択します。これにより、十分な病原性と適切な治療ウィンドウを確保しながら、迅速な1日スクリーニングの開発が可能になります。

4. 新規抗菌薬の非感染幼虫に対する毒性試験

1. 実験的に感染した幼虫に使用する前に、 Galleria mellonella の新規抗菌薬と選択したビヒクルの毒性を評価します。in vitro (細胞株など)の毒性データ(利用可能な場合)に基づいて、抗菌薬の予想される治療範囲を超える広範囲の用量を準備します。.
   1. 幼虫に10μLの治療薬が注射されることを考えてください。ビヒクルのみのコントロールを、治療薬が送達される濃度と一致する濃度で調製します。
2. ステップ3.2-3.10で詳述されているように、さまざまな抗菌剤およびPBSビヒクル濃度で、適切なグループサイズで健康で無菌の G.mellonella を注入します。本研究では、使用した抗菌薬はトブラマイシンでした。
   注:溶媒としてDMSOを必要とする薬剤の場合、DMSOを使用すると大きな針による外傷が死亡率を増加させるため、標準の22ゲージ針ではなく、26秒ゲージの針で注入してください。
3. 安全な用量を、PBSのみを注射した幼虫と比較して死亡率に大きな差がない用量と定義します。

5. 抗菌剤によるG.メロネラ菌感染症の治療の最適化

1. 感染した幼虫が10μLの用量で治療されることを考慮して、抗菌剤の用量の範囲を準備します。ステップ4で評価したように、毒性を最小限に抑えたさまざまな用量を使用してください。.
2. このプロトコルのステップ1と2に従って、以前に最適化された感染用量で適切なグループで Galleria mellonella を準備して感染させます。.
3. 感染後2時間で、調製した抗菌剤またはビヒクル制御溶液で幼虫を治療します。.手順3.2〜3.8に従い、感染時に注射した前脚とは反対の前脚に注射します。グループ間で針を滅菌します。
   注:この最適化のために2時間での治療は、強力な用量反応データを取得するために選択され、そこからその後の治療タイミングの最適化が決定された¹⁹。
4. G. mellonellaの生存を、通常最初に死亡率が観察される時点から30分間隔またはそれ以上の頻度で監視します。死んだ幼虫をすべて取り除き、死亡時刻を記録します。
5. 治療群間の生存率の変化を計算します。Kaplan-Meier生存分析を使用して、治療が幼虫の死亡率の有意な変化につながるかどうかを判断します。マルチグループ解析のペアワイズ多重度に対する適切な事後補正を含めます。

6. 感染したG. mellonellaの治療タイミングの最適化

1. 手順1と2に従って、以前に最適化された感染用量で適切なグループで Galleria mellonella を準備します。.
2. ステップ4で以前に最適化した用量で抗菌剤を調製します。
3. 感染後2時間、4時間、6時間、9時間、または12時間後に、感染した幼虫をステップ3.2〜3.8に従って治療し、治療のタイミングが死亡率にどのように影響するかを比較します。
4. G. mellonellaの生存を、通常最初に死亡率が観察される時点から30分間隔またはそれ以上の頻度で監視します。死んだ幼虫をすべて取り除き、死亡時刻を記録します。最適なタイミングは、治療用量の初期最適化後に観察された生存を維持するタイミングです。
   注: G. mellonellaの抗菌効果をテストする場合は、治療用量とタイミングの両方を別々に最適化し、前者を使用して後者の治療用量を通知します。.

ディスカッション

薬剤耐性(AMR)の負担は増加の一途をたどっています。2019年には、世界中で推定495万人がAMRに関連して死亡しました³⁰。2050年までに、AMRによる死亡率は1,000万人に達すると推定され^{ています31}。このリスクに対処するには、新規抗菌薬を効率的かつ費用対効果の高い方法で開発および試験する必要があり、抗菌薬の有効性を正確に予測する前臨床モデルを使用する必要があります。臨床試験への転換中に観察される高い離脱率は、主要な制限要因です。1件の研究では、臨床試験で失敗した13の抗菌薬候補が報告されており、11の抗菌薬候補は第II相³²に進行しませんでした。

本研究は、G. mellonellaの前臨床抗菌薬スクリーニング研究の最適化のためのフレームワークと、抗菌薬の有効性を評価するための方法を提供します。G. mellonellaの幼虫は、薬物毒性の評価、MIC測定、および病原性試験において大きな有用性を持ち、前臨床開発に使用される哺乳動物の減少に貢献しています。Galleria mellonellaの幼虫は比較的高いスループットを持ち、生物学的に関連性があり、より複雑な哺乳類モデルにうまく変換されます。一方、野生型の実験用マウスは1匹あたり8ポンドから30ポンドの費用がかかり、マウス1匹あたり週7ポンドのメンテナンスが必要ですが、G. mellonellaは50匹の幼虫に対して~2ポンドの費用がかかります。したがって、G. mellonellaモデルで10種類の化合物をテストするには、~60ポンドの費用がかかりますが、マウスでの同じ研究では4000ポンド以上かかります。さらに、以前の研究では、新規化合物の毒性と有効性を比較し、G.メロネラとマウスの急性毒性との相関関係を特定しました^8,19,33。したがって、マウスモデルでさらに試験する化合物に優先順位を付けるために、G. mellonellaスクリーニングを実装することをお勧めします。

このモデルの明らかな有用性にもかかわらず、アプリケーションを成功させるためには、いくつかの考慮事項があります。エタノール滅菌が必要であったり、研究者が自分自身のG.メロネラコロニーを維持する必要があるため、研究グレードの無菌幼虫がいないため、実験使用の準備が複雑になります。これにより、汚染のリスクが軽減され、全体的な実験品質が向上します^5,6。不適切な滅菌はかなりの死亡率をもたらす可能性があり、エタノールへの曝露時間が長くなると死に至るため、生物を完全に滅菌することは困難です。滅菌の代替方法には、感染前に各幼虫の前脚を70%エタノールで拭くことが含まれ、これにより滅菌中の死亡率は減少しますが、より労働集約的な方法です。他の消毒剤も使用できますが、この研究では代替薬は評価されていませんでしたが、エタノール滅菌を最適化すると<10%の死亡率が得られました。さらに、供給者が自身のコロニーを維持するのではなく、他の供給者から幼虫を調達する可能性があるため、供給者がG. mellonellaを抗生物質で治療しているかどうかは不明であることが多い。

G. mellonella の生物学は哺乳類とはかなり異なり、その有用性には制限があります。彼らの免疫系には適応免疫がありませんが、自然免疫の主要な可溶性および細胞性の側面は存在します。血球は 、G. mellonella の主要な自然免疫防御であり、食細胞様の特性を示します。 これらの細胞の種々のサブセットが、とりわけ顆粒球および形質細胞を含む記載されている³⁴。 G. mellonella は、呼吸器感染症や膀胱感染症などの関連する感染部位を再現することもできません。しかし、前臨床パイプラインでは、 G. mellonella はマウスモデルの事前スクリーニングとして機能し、最も有望な化合物のみが、ヒトの感染環境により近い複雑な哺乳類系に進むことを保証します。最後に、このモデルは、G. mellonellaのさらなるゲノム特性評価から、臨床的に重要なバイオマーカーの変化を評価するための適合性を判断するための利点を得るでしょう。特に、 G. mellonella の免疫についての理解を深める必要があります。

全体として、 Galleria mellonella 感染モデルは、哺乳類モデルで新規抗菌化合物を評価する前に、その前臨床評価のための貴重なツールです。供給の標準化が進んでいないため、その使用は複雑ですが、その用途はハイスループットでシンプルで、抗菌薬開発のランドスケープ全体に広く適用できます。将来的には、このモデルを標準化された前臨床パイプラインに統合することで、新しい抗菌化合物の開発を加速し、前臨床試験から臨床試験に進む候補の割合を増やすことができるかもしれません。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22s gauge, Small Hub RN Needle, 2 in, point style 2	Hamilton	7758-03	Replacement for the Hamilton syringe.
Bacterial infection stocks			Bacterial stocks of a known density (CFU/mL) frozen during mid-exponential phase of growth.
Ethanol	Fisher Scientific	10610813	Other manufacturers may be used.
G. mellonella larvae	Livefoods	5.06045E+12	For this supplier, orders are marked as “New stock for lab use”. As of April 2024, new stock is delivered to the supplier on Mondays. Orders should be placed then, for delivery on Wednesdays.
Microliter syringe	Hamilton	80630	The 80630 syringe has a 100 µL capacity. Other volumes exist, such as the 80430, 80530 or 80730.
Petri dish	Fisher Scientific	12674785	Other manufacturers may be used.