シングルセルRNAシーケンシングのための胃腸形成中のマウス胚の単離

マウス胚の分離を開始する前に、70%エタノールでその領域を完全に洗浄してください。.すべての解剖ツールが洗浄され、滅菌されていることを確認してください。10%FBSを含む5ミリリットルの滅菌DMEMと20ミリリットルのDPBSを入手し、氷の上に置きます。

次に、透過光ステージとカメラを備えた実体顕微鏡を使用して、胚の分離を行い、適切に安楽死させた妊娠中のダムを背中に置き、膣口の近くの領域をエタノールで滅菌します。解剖ハサミとピンセットを使用して、膣口の近くの皮膚の折り目を持ち上げ、小さなV字型の切り込みを入れて、妊娠中の母の子宮をゆっくりと露出させます。次に、ダムの子宮角の一方の端をピンセットで保持し、それに沿って切断することにより、ダムの子宮角を解剖します。

子宮頸部を必ず取り外してください。子宮角を氷上のDPBSを含む10センチメートルのシャーレに入れます。解剖ハサミとピンセットを使用して、着床部位に沿って子宮筋を切除し、各着床部位または内部の脱落膜腫脹を含む真珠を切断します。

氷の上の6センチメートルのシャーレに新鮮なDPBSに入れます。1つの移植部位を取ります。実体顕微鏡ステージの上にある新しい6センチメートルのペトリ皿に置き、500マイクロリットルのDPBSを追加します。

顕微鏡と光源のピントを調整します。片方の手で1セットのピンセットで移植部位を押さえ、もう一方の手で子宮角から切り取った移植部位の端に別の鉗子をゆっくりと挿入し、乳葉性の腫れを徐々に明らかにします。胚を明らかにするには、孤立した脱落膜腫脹の抗誤試行端を一方の鉗子で保持し、もう一方のペアで、誤試行端から脱乳子腫脹のサイズの約4分の1をゆっくりと水平に切り込みます。

今度は両方の鉗子で、胚が新しく切られた誤審の端から飛び出すまで、脱落子腫脹の抗誤審端からゆっくりと押し出されます。胚が明らかになったら、付着している余分な胚組織の除去に進みます。頭頂内皮嚢と外皮胎盤円錐が自然に胚から外れない場合は、一対の鉗子を使用して、関連する母体血液とともにそれらを取り除きます。

次に、1対の鉗子で胚を押さえながら、別の鉗子を使用して胚から内臓の卵黄嚢をゆっくりと剥がします。頭頂葉内胚葉嚢と外胎盤円錐を見つけます。AP 20ピペットを使用して、10マイクロリットル以下のDPBSを含む卵黄嚢を皿から氷上の8ストリップPCRチューブに移します。

分離したばかりの胚の明るい野写真を撮って、同腹仔のステージングが類似していることを確認します。P200ピペットを使用して、10%FBSを含む50マイクロリットルのDMEMを含む胚を、氷上に保持された1.5ミリリットルのチューブにゆっくりと移します。すべての脱落膜膨潤について同じことを繰り返します。これは、分離ごとに清潔なツールと新しいプラスチックを使用して行います。