この方法は、支配的な陰性バージョンを可逆的に過剰に発現させることによって、関心のある遺伝子の条件付きおよび一過性不活性化を必要とする多種多様な分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質活性の部分的なアブレーションのみを可能にし、したがって、残留内因性発現を維持する点である。しかし、ここで多量体集合体で機能するRBタンパク質の不活性化状態について述べ、この方法論は単量体タンパク質にも適用できる。
ウメシュ・ピャクレル、私たちの研究室の技術者と原稿の共著者は、手順を示します。まず、NIH3T3細胞を成長させます, ベンダーの仕様に従って, 摂氏37度で 5%CO2, 10%牛血清を含む推奨細胞培地を使用して.pTet-SpliceおよびpCMV-Tet3Gベクターを用いて細胞をコトランスフェクトするには、まず15ミリリットルチューブで脂質ベースのトランスフェクション試薬を2~4マイクロリットル、15ミリリットルチューブで1リットルの不完全なDMEMを1ml混合し、室温で5分間インキュベートする。
このトランスフェクション試薬のDMEMミックスに、井戸当たり2~3マイクログラムの血漿DNAを追加します。室温で20分間混ぜ合わせてインキュベートします。DNAとトランスフェクション試薬を含む混合物を、NIH3T3細胞を有する6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットル添加する。
5%CO2で摂氏37度で3〜4時間のインキュベーションを行った後、完全な培地を1ミリリットル加えます。次に、各ウェルに2マイクロリットルのドキシサイクリンストックを加え、プレートをプラスドキシサイクリンとしてマークします。5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートします。
予定外の細胞増殖を促進する上でのTetO-DN-CB-myc6-Rb1構築物の機能性を評価するために、10%FBSを含有するDMEM中の培養HEI-OC1細胞を、寛容な条件下で行った。細胞増殖試験では、細胞カウンターを用いてHEI-OC1細胞を数える。プレート 10,000 HEI OC1 細胞は、それぞれ 200 マイクロリットルの体積で 96 ウェル プレート上のウェルあたり。
5%CO2で摂氏33度で一晩で細胞をインキュベートします。トランスジーン発現を誘導するには、トランスフェクトしたHEI-OC1細胞のサブセットに、ドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムを加える。マイナスドキシサイクリンと非トランスフェクトHEI-OC1細胞としてラベル付けされた他のサブセットをコントロールとして使用し、細胞を10%CO2で摂氏33度としてインキュベートします。
細胞増殖を評価するために、トランスフェクションの48時間後に、細胞培養培地を取り出し、細胞増殖キットからマイクロプレートの各ウェルに100マイクロリットルの100マイクロリットルの色素結合溶液を加える。メーカーのプロトコルに従い、摂氏37度で1時間インキュベートします。蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、各サンプルの蛍光強度を測定します。
免疫細胞化学を用いて細胞増殖をさらに評価するには、HEI-OC1細胞をDMEMの12ウェルプレートの各ウェルに置かれたカバーガラスに盛り付けます。セルを摂氏33度で一晩インキュベートします。翌日、pTet-SpliceとpCMV-Tet3Gベクターを用いて2つのウェル内の細胞にコトランスフェクトし、NIH3T3細胞で行われた1つのウェルでドキシサイクリン処理を行います。
1 つの未感染をコントロールとして使用します。Ki-67標識用の細胞を処理するには、室温で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドで固定します。その後、氷冷PBSでそれぞれ5分間3回洗います。
PBSに0.25%の非イオン洗剤を加え、10分間インキュベートします。PBSで3回、それぞれ5分間洗浄を繰り返します。細胞をブロックするために10%の血清を使用してください。
室温で1時間加湿したチャンバーで。Ki-67一次抗体を500マイクロリットル加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。細胞を再びPBSで3回、それぞれ5分間洗います。
二次抗体を1ミリリットル加え、暗い温度で1時間細胞をインキュベートします。二次抗体溶液を除去した後、再び細胞を暗所のPBSで5分間3回洗浄する。HEI-OC1細胞にファロイジンを標識するには、1:200ファロイジンで室温で30分間インキュベートします。
細胞核にラベルを付けるには、DAPIの1ミリリットル当たり5マイクログラムの細胞を室温で10分間インキュベートする。トランスジーンマウスの送達後、原稿に記載されているようにCBRb1融合領域に特異的なプライマーセットを用いて子犬を遺伝子型化する。成体TetO-DN-CB-myc6-Rb1マウスをROSA-CAG-rtTAおよびテトレサイクリン誘導体ラインに繁殖させ、実験DN-CBRbマウスを生成し、原稿に記載されているように子孫を遺伝子型化する。
NIH3T3は内因性RB1タンパク質を発現しないため、ここで見られる堅牢なRB1発現は、Doxの存在下でのトランスジーン誘導によるもので、その存在しない場合、TetO-DN-CB-myc6-Rb1ミックスRB1構築物の効率的な活性化を確認する。これに対し、HEK293細胞は内因性RB1発現を有する。ドキシサイクリンの添加により、テト-DN-CB-myc6-Rb1活性化およびRB1ダウンレギュレーションが行なわれます。
RB1発現は、ドキシサイクリンを培地から除去した21時間後に再開した。HEI-OC1細胞は同じベクターでコトランスフェクトされ、ドキシサイクリンで処理されていないトランスフェクト細胞と比較してドキシサイクリン治療に続く細胞数の緩やかだが有意な増加を示した、および未感染細胞。蛍光インシンハイブリダイゼーションは、マウスにおけるTetO-DN-CB-myc6-RB1トランスジーンのゲノム挿入を確認した。
ドキシサイクリンで治療したトランスジェニックマウスの全RB1タンパク質発現の初期増加は、対照群と比較して3日間であった。しかし、7日間および10日間ドキソサイクリンで治療した群では、RB1発現の有意な低下が観察された。分析した組織に関係なく、ドキソサイクリンで治療されたトランスジェニックマウスではRB1タンパク質の有意な減少が認められたが、対照群では認められず、TetO-DN-CB-myc6-RB1構築物の効率を確認した。
この手順を試みる際には、トランスジーンの各コード要素が互いにフレームに入っていることを確認することが重要です。この報告書に記載されているカテプシンBとレチノ芽腫のコード領域が偶然、フレーム外に接続されていた場合、意図した融合タンパク質は得られないだろう。したがって、DNA配列の検証は、トランスジーンを単細胞マウス胚に注入する前に行う必要があります。
この手順に従って、ユビキタスCAGプロモーターは、細胞の特異的な方法で遺伝子機能を研究するために特定のプロモーターに置き換えることができる。
