Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в самых разнообразных областях, требующих условной и преходящей инактивации гена интереса путем обратимого чрезмерного выражения доминирующей негативной версии его. Основным преимуществом этой методики является то, что она допускает лишь частичную абляцию белковой активности, таким образом, сохраняя остаточную эндогенную экспрессию. Хотя, здесь мы описываем состояние инактивации белка РБ, который функционирует в мультимерной сборке, эта методология также может быть применена к мономерным белкам.
Умеш Пякурел, наш лабораторный техник и соавтор рукописи, продемонстрирует процедуры. Для начала выращивайте клетки NIH3T3, следуя спецификациям поставщика, при 37 градусах Цельсия с 5%CO2, используя рекомендуемую клеточную культуру среды, содержащую 10%фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Для cotransfect клетки с помощью pTet-Splice и pCMV-Tet3G векторов, сначала смешать два-четыре микролитров липидной основе трансфекции реагента на колодец, и один миллилитр неполной DMEM на колодец в 15 миллилитров трубки, и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре.
Добавьте два-три микрограмма плазменной ДНК на колодец в смесь DMEM этого трансфектного реагента. Смешайте и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре. Добавьте один миллилитр смеси, содержащей ДНК и реагент трансфекции в DMEM, к каждому колодец из шести хорошо пластины с клетками NIH3T3.
После трех-четырех часов инкубации при 37 градусах Цельсия с 5%CO2, добавьте один миллилитр полной среды. Затем добавьте 2 микролитров доксициклина к каждому колодец и отметйте пластину как плюс-доксициклин. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.
Оценить функциональность конструкции TetO-DN-CB-myc6-Rb1 в содействии незапланированному распространению клеток, культуры клеток HEI-OC1 в DMEM, содержащих 10%FBS, в разрешительных условиях. Для исследований пролиферации клеток, подсчитайте клетки HEI-OC1 с помощью клеточного счетчика. Плита 10 000 клеток HEI-OC1 на колодец на пластине 96 колодец в 200 микролитров объема каждый.
Инкубировать клетки в течение ночи при 33 градусах по Цельсию с 5%CO2. Чтобы вызвать трансгенное выражение, добавьте один микрограмм на миллилитр доксициклина в подмножество трансфицированных клеток HEI-OC1. Используйте другой подмножество помечены как минус-доксициклин и не-трансфицированных HEI-OC1 клеток в качестве элементов управления, и инкубировать клетки как 33 градусов по Цельсию с 10%CO2.
Чтобы оценить пролиферацию клеток, через 48 часов после трансфекции удалите среду клеточной культуры и добавьте 100 микролитров раствора связывания красителя 1x из комплекта пролиферации клеток в каждую колодец микро-пластины. Следуйте протоколу производителя и инкубировать в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию. Используйте считыватель микроплюсов флуоресценции для измерения интенсивности флуоресценции каждого образца.
Для дальнейшей оценки пролиферации клеток с использованием иммуноцитохимии, пластины HEI-OC1 клетки на крышку стекла размещены в каждом хорошо 12-хорошо пластины в DMEM. Инкубировать клетки на ночь при 33 градусах по Цельсию. На следующий день, cotransfect к клеткам в 2 скважинах с pTet-Splice и векторами pCMV-Tet3G, и после этого выполняет обработку доксициклина на одном наилучшим образом и сделано с клетками NIH3T3.
Используйте один неперераженый хорошо в качестве управления. Для обработки клеток для маркировки Ki-67, исправить их с 4%paraformaldehyde в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого, мыть их три раза с ледяной PBS в течение пяти минут каждый.
Добавить 0,25%неионные моющие средства в PBS, и инкубировать в течение 10 минут. Повторите мыть три раза в PBS в течение пяти минут каждый. Используйте 10%сыворотки, чтобы блокировать клетки.
В увлажненной камере в течение одного часа при комнатной температуре. Добавьте 500 микролитров первичного антитела Ки-67 и инкубировать на ночь при четырех градусах Цельсия. Вымойте клетки снова три раза в PBS в течение пяти минут каждый.
Добавьте один миллилитр вторичного антитела и инкубировать клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. После удаления вторичного раствора антитела, мыть клетки снова три раза в течение пяти минут в PBS в темноте. Чтобы обозначить клетки HEI-OC1 фаллоидином, инкубировать их в 1:200 фаллоидин в течение 30 минут при комнатной температуре.
Чтобы обозначить ядра клеток, инкубировать клетки с пятью микрограммами на миллилитр DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. После доставки трансгенных мышей генотип щенков с помощью грунтовки специфичен для области синтеза CBRb1, как описано в рукописи. Порода взрослых TetO-DN-CB-myc6-Rb1 мышей ROSA-CAG-rtTA и тетрекилин индуктор линии для создания экспериментальных DN-CBRb мышей, и генотип их потомство, как описано в рукописи.
NIH3T3 не выражает эндогенный белок RB1, поэтому надежное выражение RB1, увиденное здесь, связано с индукцией трансгена в присутствии Dox, но не в его отсутствии, подтверждая эффективную активацию конструкции TetO-DN-CB-myc6-Rb1. В отличие от этого, HEK293 клетки имеют эндогенное выражение RB1. Добавление доксициклина привело к активации TetO-DN-CB-myc6-Rb1 и регулирования RB1.
Выражение RB1 было возобновлено через 21 час после удаления доксициклина из СМИ. Клетки HEI-OC1, котрансфицированные теми же переносчиками, показали скромное, но значительное увеличение числа клеток после лечения доксициклином по сравнению с трансфицированными клетками, не обработанными доксициклином, и нетрансфицированными клетками. Флуоресцентная гибридизация на месте подтвердила геномную вставку трансгена TetO-DN-CB-myc6-RB1 у мышей.
Было первоначальное увеличение общего экспрессии белка RB1 в улитке трансгенных мышей, обработанных доксициклином в течение трех дней по сравнению с контрольной группой. Однако в группах, обработанных доксоциклиным в течение семи и 10 дней, наблюдалось значительное снижение экспрессии РБ1. Независимо от анализируемой ткани, значительное снижение белка RB1 наблюдалось у трансгенных мышей, обработанных доксоциклином, но не в контрольной группе, что подтверждает эффективность конструкции TetO-DN-CB-myc6-RB1.
При попытке этой процедуры важно проверить, что каждый из элементов кодирования трансгена находится в кадре друг с другом. Если бы описанные в настоящем докладе области кодирования катепсина В и ретинобластомы были случайно соединены из кадра, это не дало бы предполагаемого белка синтеза. Таким образом, проверка последовательности ДНК должна быть сделана перед введением трансгена в одноклеточные эмбрионы мыши.
Следуя этой процедуре, вездесущий промоутер CAG может быть заменен конкретными промоутерами для того, чтобы изучать функцию гена в специфической манере клетки.
