Este método puede ayudar a responder preguntas clave en una amplia variedad de campos que requieren inactivación condicional y transitoria de un gen de interés al sobre-expresar de manera reversible una versión negativa dominante del índolo. La principal ventaja de esta técnica es que sólo permite una ablación parcial en la actividad proteica, preservando así una expresión endógena residual. Aunque, aquí describimos la condición de inactivación de la proteína RB, que funciona en un ensamblaje multimérico, esta metodología también se puede aplicar a proteínas monoméricas.
Umesh Pyakurel, nuestro teciniciano de laboratorio y coautor en el manuscrito demostrará los procedimientos. Para empezar, el cultivo de células NIH3T3, siguiendo las especificaciones del proveedor, a 37 grados Celsius con 5%CO2, utilizando el medio de cultivo celular recomendado que contiene 10%suero bovino fetal. Para coducduccionar las células usando vectores pTet-Splice y pCMV-Tet3G, primero mezcle de dos a cuatro microlitros del reactivo de transfección a base de lípidos por pozo, y un mililitro de DMEM incompleto por pozo en un tubo de 15 mililitros, e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Añadir de dos a tres microgramos de ADN plasmático por pozo a la mezcla DMEM de este reactivo de transfección. Mezclar e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Añadir un mililitro de la mezcla que contiene ADN y el reactivo de transfección en DMEM a cada pocero de placa de seis pocillos con células NIH3T3.
Después de tres a cuatro horas de incubación a 37 grados Celsius con 5%CO2, añadir un mililitro de medio completo. A continuación, agregue 2 microlitros de caldo de doxiciclina a cada pozo y marque la placa como más doxiciclina. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5%CO2.
Para evaluar la funcionalidad de la construcción TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en la promoción de la proliferación celular no programada, cultivo de células HEI-OC1 en DMEM que contiene 10%FBS, en condiciones permisivas. Para estudios de proliferación celular, cuente las células HEI-OC1 utilizando un contador de células. Placa 10.000 células HEI-OC1 por pozo en una placa de 96 pozos en 200 microlitros de volumen cada una.
Incubar las células durante la noche a 33 grados centígrados con 5%CO2. Para inducir la expresión de transgén, agregue un microgramos por mililitro de doxiciclina a un subconjunto de células HEI-OC1 transfectosas. Utilice el otro subconjunto etiquetado como menos-doxiciclina y las células HEI-OC1 no transfectadas como controles, e incubar las células como 33 grados Celsius con 10%CO2.
Para evaluar la proliferación celular, 48 horas después de la transfección, retire el medio de cultivo celular y agregue 100 microlitros de solución de unión de tinte 1x de un kit de proliferación celular a cada pocólite de la microplaca. Siga el protocolo del fabricante e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Utilice un lector de microplacas de fluorescencia para medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra.
Para evaluar aún más la proliferación celular mediante inmunocitoquímica, placa las células HEI-OC1 en un vidrio de cubierta colocado en cada pozo de una placa de 12 pozos en DMEM. Incubar las células durante la noche a 33 grados centígrados. Al día siguiente, cotransfecta a las células en dos pozos con el pTet-Splice y los vectores pCMV-Tet3G, y luego realizar el tratamiento de doxiciclina en uno bien como se hace con las células NIH3T3.
Utilice uno no infectado, así como un control. Para procesar las celdas para el etiquetado Ki-67, fijelas con 4%paraformaldehído en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, lávelos tres veces con PBS helado durante cinco minutos cada uno.
Añadir 0.25% detergente no iónico en PBS, e incubar durante 10 minutos. Repita el lavado tres veces en PBS durante cinco minutos cada uno. Usa 10% de suero para bloquear las células.
En una cámara humidificada durante una hora a temperatura ambiente. Añadir 500 microlitros de anticuerpos primarios Ki-67 e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las células de nuevo tres veces en PBS durante cinco minutos cada una.
Añadir un mililitro del anticuerpo secundario e incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de extraer la solución secundaria de anticuerpos, lave las células de nuevo tres veces durante cinco minutos en PBS en la oscuridad. Para etiquetar las células HEI-OC1 con falhalloidina, incubarlas en 1:200 faloidein durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Para etiquetar los núcleos celulares, incubar las células con cinco microgramos por mililitro de DAPI Durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la entrega de los ratones transgene, genotipo los cachorros utilizando un conjunto de imprimación específico para la región de fusión CBRb1 como se describe en el manuscrito. Criar ratones adultos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 a la línea de inductores ROSA-CAG-rtTA y tetrecycline para generar ratones DN-CBRb experimentales, y genotipo su descendencia como se describe en el manuscrito.
NIH3T3 no expresa la proteína RSB1 endógena, por lo que la robusta expresión RB1 que se ve aquí se debe a la inducción transgén en presencia de Dox, pero no en su ausencia, confirmando la activación eficiente de la construcción RB1 de mezcla TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Por el contrario, las células HEK293 tienen expresión de RB1 endógena. La adición de doxiciclina llevó a TetO-DN-CB-myc6-Rb1 activación y RB1 down-regulation.
La expresión RB1 se reanudó 21 horas después de que se retirara la doxiciclina de los medios. Las células HEI-OC1 cotransfectadas con los mismos vectores, mostraron un aumento modesto pero significativo en el número de células siguen el tratamiento de doxiciclina en comparación con las células transfectadas no tratadas con doxiciclina, y las células no transfectadas. La hibridación fluorescente in situ confirmó la inserción genómica del transgén TetO-DN-CB-myc6-RB1 en ratones.
Hubo un aumento inicial en la expresión total de proteína RB1 en cóclea de los ratones transgénicos tratados con doxiciclina durante tres días en comparación con el grupo de control. Sin embargo, en grupos tratados con doxociclina durante siete y 10 días, se observó una reducción significativa en la expresión de RB1. Independientemente del tejido analizado, se observó una reducción significativa de la proteína RB1 en ratones transgénicos tratados con doxociclina, pero no en el grupo de control, lo que confirma la eficiencia de la construcción TetO-DN-CB-myc6-RB1.
Al intentar este procedimiento, es importante comprobar que cada uno de los elementos de codificación del transgén están en fotograma entre sí. Si las regiones codificantes de Cathepsin B y el retinoblastoma descritos en este informe estuvieran, por casualidad, conectadas fuera de marco, no produciría la proteína de fusión prevista. Por lo tanto, la verificación de la secuencia de ADN debe realizarse antes de inyectar el transgén en embriones de ratón de una sola célula.
Después de este procedimiento, el ubicuo promotor CAG puede ser reemplazado por promotores específicos con el fin de estudiar la función génica de la manera específica de una célula.
