يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجموعة واسعة من المجالات التي تتطلب تعطيلًا مشروطًا وعابرًا لجين من الاهتمامات من خلال الإفراط في التعبير عن نسخة سلبية مهيمنة منه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تسمح إلا بالاستئصال الجزئي في نشاط البروتين ، وبالتالي الحفاظ على تعبير داخلي متبقي. على الرغم من أن، هنا وصفنا لتكف عن حالة بروتين RB، الذي يعمل في الجمعية متعددة اميرك، يمكن أيضا تطبيق هذه المنهجية على البروتينات أحادية الهجاء.
سوف أوميش بياكوريل، techinician المختبر لدينا ومؤلف مشارك في المخطوطة إظهار الإجراءات. للبدء، تنمو خلايا NIH3T3، بعد مواصفات البائع، في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وذلك باستخدام المتوسطة ثقافة الخلية الموصى بها التي تحتوي على مصل الأبقار الجنين 10٪. cotransfect الخلايا باستخدام pTet-Splice وpCMV-Tet3G ناقلات, خلط أول اثنين إلى أربعة microliters من مبيد transfection القائم على الدهون في البئر, وميليلتر واحد من DMEM غير مكتملة لكل بئر في أنبوب 15 ملليلتر, واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
إضافة اثنين إلى ثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي البلازما في بئر لهذا المزيج DMEM مُشفر إعادة الإرسال. اخلطي و احتضني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة ملليلتر واحد من المزيج الذي يحتوي على الحمض النووي ومعشف transfection في DMEM إلى كل بئر من ستة بئر لوحة مع خلايا NIH3T3.
بعد ثلاث إلى أربع ساعات من الحضانة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، إضافة ملليلتر واحد من المتوسط الكامل. ثم، إضافة 2 ميكرولترات من الأسهم دوكسيسيكلين إلى كل بئر ووضع علامة على لوحة كما زائد doxycycline. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
لتقييم وظيفة TetO-DN-CB-myc6-Rb1 في تعزيز انتشار الخلايا غير المجدولة، والخلايا HEI-OC1 الثقافة في DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS، في ظل ظروف التساهل. بالنسبة لدراسات انتشار الخلايا، عد خلايا HEI-OC1 باستخدام عداد الخلايا. لوحة 10، 000 خلايا HEI-OC1 في بئر على لوحة 96-well في 200 ميكرولترات الحجم لكل منها.
احتضان الخلايا على مدى الليل في 33 درجة مئوية مع 5٪ CO2. للحث على التعبير transgene، إضافة ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من doxycycline إلى مجموعة فرعية من الخلايا الحاملة للعدوى- OC1. استخدم المجموعة الفرعية الأخرى المسماة باسم ناقص دوكسيسيكلين وخلايا HEI-OC1 غير الحاملة للعدوى كضوابط، وحضن الخلايا كـ 33 درجة مئوية مع 10٪ CO2.
لتقييم انتشار الخلايا، بعد 48 ساعة من نقل الدم، إزالة خلية ثقافة المتوسطة وإضافة 100 ميكرولترات من 1x صبغة ملزمة الحل من طقم انتشار الخلايا إلى كل بئر من لوحة صغيرة. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. استخدم قارئ الفلورسينت الصغير لقياس شدة الفلورنس لكل عينة.
لمزيد من تقييم انتشار الخلايا باستخدام الكيمياء المناعية، لوحة خلايا HEI-OC1 على غطاء الزجاج وضعت في كل بئر من 12-بئر لوحة في DMEM. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 33 درجة مئوية. في اليوم التالي، cotransfect إلى الخلايا في بئرين مع pTet-Splice وناقلات pCMV-Tet3G، ومن ثم تنفيذ العلاج دوكسيسيكلين على واحد بشكل جيد كما فعلت مع الخلايا NIH3T3.
استخدام واحد غير نقل أيضاً كما عنصر تحكم. لمعالجة الخلايا لوضع العلامات كي 67، وإصلاحها مع 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يغسل لهم ثلاث مرات مع الجليد البارد برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منهما.
إضافة 0.25٪ المنظفات غير المؤينة في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 10 دقائق. كرر غسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل من. استخدام مصل 10٪لمنع الخلايا.
في غرفة مرطبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 500 ميكرولترات من الأجسام المضادة الابتدائية كي-67 واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. غسل الخلايا مرة أخرى ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل من.
أضف ملليلتر واحد من الأجسام المضادة الثانوية واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية، وغسل الخلايا مرة أخرى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني في الظلام. لتسمية خلايا HEI-OC1 مع phalloidin، احتضان لهم في 1:200 phalloidin لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
لتسمية نواة الخلية، احتضان الخلايا بخمس ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد تسليم الفئران transgene، genotype الجراء باستخدام مجموعة التمهيدي محددة لمنطقة الانصهار CBRb1 كما هو موضح في المخطوطة. تولد الكبار TetO-DN-CB-myc6-Rb1 الفئران إلى ROSA-CAG-RTTA وخط تحريض tetrecycline لتوليد الفئران DN-CBRb التجريبية، وgenotype ذريتهم كما هو موضح في المخطوطة.
NIH3T3 لا يعبر عن البروتين RB1 الذاتية، وبالتالي فإن التعبير RB1 قوية ينظر هنا هو بسبب تحريض transgene في وجود دوكس، ولكن ليس في غيابها، مما يؤكد تفعيل كفاءة من TetO-DN-CB-myc6-RB1 مزيج RB1 بناء. في المقابل، تحتوي خلايا HEK293 على تعبير RB1 داخلي. إضافة doxycycline أدى إلى TetO -DN-CB-myc6-Rb1 التنشيط وR RB1 أسفل التنظيم.
تم استئناف التعبير RB1 21 ساعة بعد إزالة doxycycline من الوسائط. خلايا HEI-OC1 cotransfected مع نفس النواقل، وعرض زيادة متواضعة ولكن كبيرة في عدد الخلايا تتبع العلاج doxycycline مقارنة مع الخلايا المصابة لا تعامل مع دوكسيسيكلين، والخلايا غير المنقولة. وأكد التهجين الفلوري في الموقع الإدراج الجينومي لـ TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgene في الفئران.
كانت هناك زيادة أولية في مجموع التعبير البروتين RB1 في قوقعة الفئران المعدلة وراثيا تعامل مع دوكسيسيكلين لمدة ثلاثة أيام بالمقارنة مع مجموعة التحكم. ومع ذلك، في المجموعات تعامل مع دوكسوسيكلين لمدة سبعة و 10 أيام، لوحظ انخفاض كبير في التعبير RB1. بغض النظر عن الأنسجة التي تم تحليلها ، لوحظ انخفاض كبير في بروتين RB1 في الفئران المعدلة وراثيا تعامل مع دوكسوسيكلين ، ولكن ليس في مجموعة التحكم ، مما يؤكد كفاءة بناء TetO-DN-CB-myc6-RB1.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم التحقق من أن كل عنصر من عناصر الترميز في transgene في الإطار مع بعضها البعض. إذا كانت مناطق الترميز من Cathepsin B والورم الأرومي الشبكي الموصوف في هذا التقرير ، عن طريق الصدفة ، متصلة خارج الإطار ، فإنها لن تسفر عن بروتين الانصهار المقصود. وهكذا، يجب التحقق من تسلسل الحمض النووي قبل حقن transgene في الأجنة الماوس وحيد الخلية.
بعد هذا الإجراء، يمكن استبدال المروج CAG في كل مكان مع المروجين محددة من أجل دراسة وظيفة الجينات بطريقة محددة الخلية.
