我々のプロトコルは、血管回帰を研究するための有用な実験モデルとして、目の中のヒアルロイド血管系を視覚化し、特徴付けるためのin vivoとex vivoの両方の尺度を提供します。この技術は、生きたマウスにおけるヒヤロイド血管のインビボ縦断観察と、解剖された全ヒアロイド血管の正確な定量化とを組み合わせたものです。我々の技術は、持続性胎児血管系の病因および基本的メカニズムを研究するための実用的かつ実現可能な方法を提供する。
この方法はまた、他の器官の血管新生研究に関連する可能性のある眼血管退縮の調節に関与する細胞および分子メカニズムに関する洞察を提供する。ヒヤロイドの分離手順は、初心者にとって技術的に困難な場合があります。練習と忍耐の多くは、解剖を成功させるために役立ちます。
この方法を視覚化すると、より効率的にスキルを習得するのに役立つテクニックに関する詳細な実践的な情報とヒントが提供されます。光コヘレンス断層撮影またはOCTイメージングの場合、眼科画像の視野の中心に光神経ヘッドが配置されるようにマウスとプローブを調整し、画像を取得する前に、OCTイメージングソフトウェアで示された線の焦点と角度を調整して、持続性のヒアロイド血管を明らかにする。ヒアロイド血管の眼管フルオレセイン血管造影画像の場合、視神経ヘッドを視野の中央に配置するように調整し、顕微鏡フィルターを緑色の蛍光チャネルに変更します。
次に、持続性ヒアロイド血管に焦点を当て、注入後1、3、5、および10分で複数の画像を得て、血管を観察するための信号対バックグラウンド比の最適なタイムポイントを決定します。ex vivoヒアロイド血管解剖および可視化では、マイクロサージャリー鉗子を使用して出生後8日目マウスのまぶたを開き、片目の軌道に地球の下に湾曲したマイクロ手術鉗子を置き、眼球を絞らずに視神経をつかむ。眼球を鉗子で軽く引っ張って取り外し、室温で4%パラホルムアルデヒドで目を固定します。
30分後、解剖顕微鏡下で固定眼球を氷冷PBSに移し、50マイクロリットルのゼラチン溶液を、四肢の周りの4つの異なる等間隔の部位で眼球の膜炎体に注入する。その後、氷の上に眼球を30分間インキュベートし、注入したゼラチンを膜領域内で固めます。ゼラチンが硬化すると、眼球を解剖顕微鏡下でPBSのペトリ皿に移し、マイクロサージャスハサミを使用して手足を切開して角膜を取り除きます。
切り取り、解剖顕微鏡の下で視神経を取り除きます。2組の鉗子を使用して、強膜、脈絡膜および網膜色素上皮層を剥離して捨て、続いて虹彩を除去する。レチナの視神経側が上を向き、レンズが下を向いている場合、レチナカップのすぐ下に50マイクロリットルのPBSを注入して、ゼラチン化された亜質体とレチナの間にPBSの蓄積を可能にする。
マイクロサージャリー鉗子を使用して、生膜からレティナカップと毛様体を穏やかに剥がします。転写ピペットを用いて、PBSに浸漬したヒアロイド組織を含むゼラチンカップを顕微鏡スライドに移す。そして、レンズが上向きになるように残りの組織をひっくり返します。
その後、レンズを持ち上げ、レンズチュニカ血管系レンティスと血管状血管の支柱との間の接続を穏やかに緩めてから、マイクロサージャリージャスハサミでヒャロイド動脈を切断してレンズチュニカ血管系レンティスを取り除きます。平らなマウントのためのヒアロイドカップのバサヒャロイデプロリア領域を保ちます。ヒアロイド容器サンプルの平らな取り付けのために、任意の解剖破片を除去するために、新鮮なPBSでヒアロイドカップを静かにすすいだ。
PBSに浮かぶ組織では、マイクロサージャリード鉗子を使用して、ゼラチン化されたヒアロイドカップの位置を穏やかに配置し、カップの縁が下向きになるように調整します。ヒアロイドカップをPBSに浸してスライドを37度のスライドウォーマーに置きます。ゼラチンが溶けてヒアロイドが平らにした後、かろうじて乾燥しているときにスライドを取り除き、DAPIでアンチフェード実装媒体を一滴加えてヒアロイド血管の核を染色します。
その後、ヒアロイドにカバースリップをそっと置き、フラットマウントを完成させます。DAPI染色を画像化するために、その取り付けられたサンプルを蛍光顕微鏡のステージに移し、中央のヒアロイド動脈が見えることを確認する。次に、ヒアロイド動脈から直接導出された血管枝を特定し、定量のために容器の枝の数を手動で数える。
ここでは、3ヶ月前の野生型および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5またはLRP5ノックアウトマウスにおける残膜およびヒアロイド組織のOCT画像の断面図が、持続性ヒアロイド血管を有する動物モデルである、図示されている。これらの眼管フルオレスセイン血管の持続的なヒアロイド血管の血管造影画像は、6週齢のノックアウトマウスの膜炎の体内で観察されるが、同じ年齢の野生型動物ではヒアルロイド血管の残骸は観察されない。これらのヒアロイド血管では、血管細胞および関連するマクロファージを平らに取り付け、それらの核DAPI染色によって同定することができる。
そして、中央ヒアロイド動脈から分岐する細胞の各行は、血管の血管を表す血管の血管を表す。野生型マウスは出生後8日目に平均12のヒアロイド血管の枝を有し、年齢に合わせたLRP5ノックアウト子犬はヒアロイド血管の約25の枝を示し、ヒアロイド血管構造の著しく損なわれた退縮を示す。さらに、遅延および不完全なretina血管の発達は、LRP5ノックアウトの子犬にも観察される。
実際、ヒアロイド血管は、出生後8日目にLRP5ノックアウト眼組織切片の断面で同定することができる。一方、野生のタイプの目はもはやこれらの容器を表示しません。覚えておくべきことの最も重要なことは、ヒアロイド系を眼部および他の眼組織から分離する際に、穏やかで忍耐強くないことです。
異なる細胞マーカーを用いた免疫染色を行うヒアロイド血管を単離した後、ヒアロイド退縮を調節する細胞相互作用を明らかにすることができる。この技術は、眼血管新生研究における持続性胎児血管系の基礎となる細胞および分子メカニズムを探る。パラホルムアルデヒド、ケタミン、キシラジンは危険です。
適切な個人用保護具を使用して、化学発煙フードにこれらの試薬を準備してください。
