Protokolümüz, göz içindeki hyaloid vaskülatürü vasküler regresyon eğitimi için yararlı bir deneysel model olarak görselleştirmek ve karakterize etmek için hem in vivo hem de ex vivo önlemler vermektedir. Bu teknik canlı farelerde hyaloid damarların in vivo longitudinal gözlem ve ex vivo görselleştirme ve parçalanmış tüm hyaloid damarların doğru nicel leştirme birleştirir. Tekniğimiz, kalıcı fetal vaskülatürün patogenezi ve temel mekanizmalarının incelenmesi için pratik ve uygulanabilir bir yöntem sağlar.
Bu yöntem aynı zamanda diğer organlarda anjiyogenez araştırmaları için ilgili olabilir oküler vasküler regresyon düzenlenmesinde yer alan hücresel ve moleküler mekanizmalar içine fikir sağlar. Hyaloid izolasyon adımları teknik olarak yeni başlayanlar için zor olabilir. Uygulama ve sabır Bol başarılı bir diseksiyon sağlamak için yardımcı olacaktır.
Bu yöntemi görselleştirmek, izleyicilere becerilerde daha verimli bir şekilde ustalaşmalarında yardımcı olabilecek teknik hakkında ayrıntılı uygulamalı bilgiler ve ipuçları sağlayacaktır. Optik koherens tomografisi veya OCT görüntüleme için, fareyi ve sondayı, optik sinir başlığının fundus görüntüsündeki görme alanının merkezinde olması için ayarlayın ve görüntüleri elde etmeden önce kalıcı hyaloid damarları ortaya çıkarmak için OCT görüntüleme yazılımında belirtilen çizginin odak ve açısını ayarlayın. Hyaloid damarların fundus floresan anjiyografi görüntüleme için, görüş alanının merkezinde optik sinir kafası konumlandırmak ve yeşil floresan kanal mikroskop filtresi değiştirmek için biraz hizalama ayarlayın.
Daha sonra kalıcı hyaloid damarlara odaklanın ve damarları gözlemlemek için sinyal-arka plan oranı için en iyi zaman noktasını belirlemek için enjeksiyon sonrası bir, üç, beş ve 10 dakika birden fazla görüntü elde edin. Ex vivo hyaloid damar diseksiyonu ve görselleştirme için bir postnatal gün-sekiz fare göz kapaklarını açmak ve göz küresi sıkma olmadan optik sinir kavramak için bir gözün yörüngesinde dünya altında kavisli mikrocerrahi forseps yerleştirmek için mikrocerrahi forseps kullanın. Yavaşça çekin ve forseps ile göz küresi kaldırmak ve oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit göz düzeltmek.
30 dakika sonra sabit göz kürelerini bir diseksiyon mikroskobu altında buz gibi PBS'ye aktarın ve 50 mikrolitre jelatin çözeltisini göz küresinin vitreus vücuduna limbus çevresindeki dört farklı eşit aralıklı alanda enjekte edin. Daha sonra vitreus alanı içinde enjekte jelatin katılaşmak için 30 dakika buz üzerinde göz küresi kuluçka. Jelatin tedavi olduğunda, göz küresini diseksiyon mikroskobu altında PBS'nin Petri kabına aktarın ve korneayı çıkarmak için limbusta bir kesi yapmak için mikrocerrahi makas kullanın.
Kesip inceleyerek mikroskop altında optik sinir kaldırmak. İki çift forceps kullanarak sklera, koroid ve retinapigment epitel tabakalarını soyup atın, ardından iris inçıkarılması. Retinanın optik sinir tarafı yukarı bakacak ve lensler aşağı bakacak şekilde, jelatinize vitreus vücut ve retina arasında PBS birikimine izin vermek için retina fincan hemen altında PBS 50 mikrolitre enjekte.
Hafifçe vitreus vücuttan retina fincan ve silikal vücut soymak için mikrocerrahi forceps kullanın. Bir transfer pipet kullanarak bir mikroskop slayt PBS dalmış hyaloid doku içeren jelatin fincan aktarın. Ve lens yukarı bakacak şekilde kalan dokuları ters çevirin.
Sonra lens kaldırın ve yavaşça lens tunica vasculosa lentis ve vasa hyaloidea propria lens tunica vasculosa lentis kaldırmak için mikrocerrahi makas ile hyaloid arter kesmeden önce arasındaki bağlantıyı gevşetin. Düz montaj için hyaloid fincan vasa hyaloidea propria bölge tutun. Hyaloid damar örnekleridüz montaj için yavaşça taze PBS ile hyaloid fincan durulayın herhangi bir diseksiyon enkaz kaldırmak için.
PBS yüzen doku ile yavaşça düzenlemek ve fincan kenarı aşağı bakacak şekilde jelatinize hyaloid fincan konumunu ayarlamak için mikrocerrahi forceps kullanın. PBS'ye batırılmış hyaloid fincanı olan slaytı 37 santigrat derecedebir kaydırak ısıtıcısına yerleştirin. Jelatin erir ve hyaloid düzleştirir sonra zar zor kuru ve hyaloid kaplarda çekirdekleri leke DAPI ile anti-fade montaj ortamı bir damla eklemek slayt kaldırmak.
Sonra yavaşça düz montaj tamamlamak için hyaloid bir coverslip yerleştirin. Hyaloid damarların DAPI boyama görüntü bir floresan mikroskop aşamasına monte örnek transfer ve merkezi hyaloid arter görünür olduğunu doğrulamak için. Daha sonra doğrudan hyaloid artertüretilen damar dalları belirlemek ve elle quantification için damar dallarının sayısını saymak.
Burada, üç aylık yabani tip ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ilişkili protein beş veya LRP5 nakavt fareler, kalıcı hyaloid damarları ile bir hayvan modeli retina ve hyaloid dokular için OCT görüntüleri kesitsel görünümleri gösterilmiştir. Bu fundus floresan anjiyografide, altı haftalık nakavt farelerin vitreus vücudunda, aynı yaştaki yabani tip hayvanlarda ise, kalıcı hyaloid damarların sekiz dalı gözlenen bir anjiyografi görüntüleri görülmektedir. Bu hyaloid damar düz vasküler hücreleri bağlar ve ilişkili makrofajlar onların nükleer DAPI boyama ile tespit edilebilir.
Ve merkezi hyaloid arter dallanmış hücrelerin her satır vasa hyaloidea propria bir damar temsil eder. Yabani tip fareler doğum sonrası sekizinci günde ortalama 12 dal hyaloid damara sahipken, yaşla eşleşen LRP5 nakavt yavruları hyaloid vaskülature'un önemli ölçüde bozulmuş regresyonunu gösteren 25 dal hyaloid damarda sergilenmektedir. Buna ek olarak, gecikmiş ve eksik retina vasküler gelişim de LRP5 nakavt yavru görülür.
Nitekim, hyaloid damarlar hala doğum sonrası gün sekiz LRP5 nakavt göz dokusu bölümlerinin kesitlerinde tespit edilebilir. Oysa vahşi tip gözler artık bu damarları göstermiyor. Hatırlanması gereken en önemli şey retina ve diğer oküler dokulardan hyaloid sistemi izole ederken nazik ve sabırlı olmaktır.
Hyaloid damarları izole ettikten sonra farklı hücre belirteçleri ile immünboyama hyaloid regresyon düzenleyen hücresel etkileşimleri ortaya çıkarmak için yapılabilir. Bu teknik, oküler anjiyogenez araştırmalarında kalıcı fetal vaskülatürin altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmalarını inceler. Paraformaldehit, ketamin ve ksilazin tehlikelidir.
Lütfen bu reaktifleri uygun kişisel koruyucu ekipmanı kullanarak kimyasal duman kaputuna hazırlayın.
