הערכה ואפיון של אוניות היאלואיד בעכברים

הפרוטוקול שלנו מספק הן ב vivo והן אקס ויוו אמצעים להדמיה ואפיון כלי הדם hyaloid בתוך העין כמודל ניסיוני שימושי לחקר רגרסיה כלי דם. טכניקה זו משלבת הן התבוננות אורך vivo של כלי hyaloid בעכברים חיים ו ex vivo הדמיה וכמות מדויק של כלי לשון שלמים נותקו. הטכניקה שלנו מספקת שיטה מעשית וישים לחקר הפתוגנזה ומנגנונים בסיסיים של כלי דם עובריים מתמשכים.

שיטה זו מספקת גם תובנה על מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בוויסות רגרסיה של כלי הדם העין אשר עשוי להיות רלוונטי למחקר אנגיוגנזה באיברים אחרים. צעדי הבידוד של הלשון עשויים להיות מאתגרים מבחינה טכנית למתחילים. שפע של תרגול וסבלנות יעזרו להבטיח ניתוח מוצלח.

הדמיה של שיטה זו תספק מידע מפורט מעשי וטיפים על הטכניקה שעשויה לסייע לצופים לשלוט במיומנויות בצורה יעילה יותר. עבור טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית או הדמיה OCT, להתאים את העכבר ואת החללית כך ראש העצב האופטי הוא במרכז השדה החזותי בתדמית fundus ולהתאים את המיקוד ואת הזווית של הקו המצוין בתוכנת ההדמיה OCT כדי לחשוף את כלי hyaloid מתמשך לפני קבלת תמונות. עבור הדמיה אנגיוגרפיה של פונדוס פלואורסצ'ין של כלי הלשון, התאם מעט את היישור כדי למקם את ראש עצב הראייה במרכז שדה הראייה ולשנות את מסנן המיקרוסקופ לערוץ פלואורסצנטי ירוק.

לאחר מכן התמקדו בכלי הלשון המתמשכים והשגת תמונות מרובות לאחר 1, 3, 5 ו-10 דקות כדי לקבוע את נקודת הזמן הטובה ביותר ליחס האות לרקע להתבוננות בכלי הדם. עבור ניתוח כלי hyaloid ex vivo והדמיה להשתמש מדפים microsurgery כדי לפתוח את העפעפיים של עכבר יום שמונה לאחר הלידה למקם מעצורי מיקרו-כירורגיה מעוקל מתחת לגלובוס במסלול של עין אחת כדי לתפוס את עצב הראייה מבלי לסחוט את גלגל העין. משוך בעדינות והסר את גלגל העין במטלות ותקן את העין בפרפורמלדהיד של 4% בטמפרטורת החדר.

לאחר 30 דקות מעבירים את גלגלי העיניים הקבועים ל-PBS קר כקרח תחת מיקרוסקופ דיסקט ומזריקים 50 מיקרוליטרים של תווי ג'לטין לגוף זקיף של גלגל העין בארבעה אתרים שונים במים באופן שווה סביב הלימבוס. ואז להחדיר את גלגל העין על הקרח במשך 30 דקות כדי לחזק את הג'לטין מוזרק בתוך החלל הזוע. כאשר הג'לטין ריפא להעביר את גלגל העין לצלחת פטרי של PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש מספריים מיקרוכירורגיה לעשות חתך בלימבוס כדי להסיר את הקרנית.

לחטוף ולהסיר את עצב הראייה מתחת למיקרוסקופ ניתוח. באמצעות שני זוגות של מלקחיים לקלף ולהשליך את סקלרה, choroid ו שכבות אפיתל פיגמנט רשתית, ואחריו הסרת הקשתית. עם צד עצב הראייה של הרשתית פונה כלפי מעלה ואת העדשות פונה כלפי מטה, להזריק 50 microliters של PBS ממש מתחת לגביע הרשתית כדי לאפשר הצטברות של PBS בין הגוף ג'לטין ו הרשתית.

השתמש ממטרים מיקרוכירורגיה בעדינות לקלף את הרשתית ואת הגוף ciliary מהגוף הזיוף. באמצעות צינור העברה להעביר את ג'לטין המכיל את רקמת hyaloid שקוע PBS לשקופית מיקרוסקופ. ולהפוך את הרקמות הנותרות מעל כך העדשה פונה כלפי מעלה.

ואז להרים את העדשה בעדינות לשחרר את הקשר בין העדשה טוניקה vasculosa lentis ואת vasa hyaloidea פרופריה לפני חיתוך עורק hyaloid עם מספריים מיקרו-כירורגיה כדי להסיר את העדשה טוניקה vasculosa lentis. שמור את אזור פרופריה hyaloidea vasa של hyaloid עבור הר שטוח. להרכבה שטוחה של דגימות כלי הלשון לשטוף בעדינות את hyaloid עם PBS טרי כדי להסיר את כל פסולת ניתוח.

עם הרקמה צפה PBS להשתמש מטליסי מיקרו-כירורגיה כדי לסדר בעדינות ולהתאים את המיקום של הלשון gelatinized כך שפת ה פונה כלפי מטה. מניחים את השקופית עם הלשון שקוע PBS על שקופית חם ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הג'לטין נמס ואת משטחי hyaloid להסיר את השקופית כאשר הוא בקושי יבש ולהוסיף טיפה של מדיום הרכבה נגד דהוי עם DAPI כדי להכתים את הגרעינים בכלי הלשון.

לאחר מכן מניחים בעדינות כיסוי על הלשון כדי להשלים את ההר השטוח. כדי לדמיין את כתמי ה- DAPI של כלי הלשון להעביר את המדגם רכוב על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולאשר כי העורק hyaloid המרכזי גלוי. לאחר מכן זהה את ענפי כלי השיט הנגזרים ישירות מהעורק ההיאלואידי וספיר ידנית של מספר ענפי כלי השיט לכמות.

כאן, תצוגות חתך של תמונות OCT עבור רקמות הרשתית וההיאלואידים בסוג בר בן שלושה חודשים וחלבון הקשור לקולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה חמישה או עכברי נוקאאוט LRP5, מודל בעלי חיים עם כלי לשון מתמשכים, מוצגים. אלה תמונות אנגיוגרפיה fundus fluorescein של כלי hyaloid מתמשך שמונה ענפים של כלי hyaloid נצפו בגוף זקיף של עכברי נוקאאוט בן שישה שבועות בעוד שום תמורת של כלי hyaloid נצפתה בבעלי חיים מסוג בר באותו גיל. אלה כלי hyaloid שטוח עולה תאי כלי הדם מקרופאגים הקשורים ניתן לזהות על ידי כתמי DAPI הגרעיני שלהם.

וכל שורה של תאים המתעקלים מהעורק ההיאלואידי המרכזי מייצגת כלי אחד של פרופריה של ואסה היאלואידיה. עכברים מסוג בר יש בממוצע 12 ענפים של כלי hyaloid ביום שלאחר הלידה שמונה, בעוד גיל תואם LRP5 נוקאאוט גורים התערוכה סביב 25 ענפים של כלי hyaloid המדגים רגרסיה לקויה באופן משמעותי של כלי דם hyaloid. בנוסף, עיכוב ופיתוח כלי דם רשתית לא שלם נצפתה גם גורים נוקאאוט LRP5.

אכן, כלי לשון עדיין ניתן לזהות חתך של LRP5 נוקאאוט רקמת העין קטעים ביום שלאחר הלידה שמונה. בעוד שעיניים פראיות כבר לא מציגות את הכלים האלה. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להיות עדין וסבלני בעת בידוד מערכת הלשון מן הרשתית ורקמות עינית אחרות.

לאחר בידוד כלי הלשון immunostaining עם סמני תאים שונים ניתן לבצע כדי לחשוף את האינטראקציות הסלולר ויסות רגרסיה hyaloid. טכניקה זו בוחנת את המנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים של כלי דם עובריים מתמשכים במחקר אנגיוגנזה עינית. פרפורמלדהיד, קטמין וקסילאזין מסוכנים.

נא להכין את אלה reagents במכסה המנוע אדים כימיים באמצעות ציוד מגן אישי הנכון.