당사의 프로토콜은 혈관 회귀를 연구하기 위한 유용한 실험 모델로 서눈 내의 히알로이드 혈관을 시각화하고 특성화하기 위한 생체 내 및 전 생체 내 측정값을 모두 제공합니다. 이 기술은 살아있는 마우스와 전 생체 시각화 및 해부된 전체 hyaloid 용기의 정확한 정량화를 통해 히알로이드 용기의 생체 내 세로 관측을 결합합니다. 우리의 기술은 지속적인 태아 혈관의 병기 및 기초 기계장치를 연구하기 위한 실용적이고 실행 가능한 방법을 제공합니다.
이 방법은 또한 그밖 기관에 있는 혈관신생 연구를 위해 관련있을 수 있는 안구 혈관 회귀의 규칙에 관련되었던 세포 및 분자 기계장치에 통찰력을 제공합니다. hyaloid 절연 단계는 초보자를 위한 기술적으로 도전적일 지도 모릅니다. 많은 연습과 인내심이 성공적인 해부를 보장하는 데 도움이 될 것입니다.
이 방법을 시각화하면 시청자가 기술을 보다 효율적으로 마스터하는 데 도움이 될 수 있는 기술에 대한 자세한 실습 정보와 팁을 제공합니다. 광학 일관성 단층 촬영 또는 OCT 이미징의 경우, 마우스와 프로브를 조정하여 광학 신경 헤드가 fundus 이미지의 시야 중심에 있도록 조정하고 OCT 이미징 소프트웨어에서 표시된 선의 초점과 각도를 조정하여 이미지를 얻기 전에 지속적인 hyaloid 용기를 드러냅니다. hyaloid 용기의 fundus 형광 혈관 학화상 화상 진찰의 경우, 시신경 헤드를 시야 의 중심에 배치하고 현미경 필터를 녹색 형광 채널로 변경하도록 정렬을 약간 조정합니다.
그런 다음 지속적인 hyaloid 용기에 초점을 맞추고 혈관을 관찰하기 위한 신호 대 배경 비율에 가장 적합한 시간 지점을 결정하기 위해 1, 3, 5 및 10 분 후 사사 에서 여러 이미지를 얻습니다. 전 생체 효로이드 용기 해부 및 시각화의 경우 미세 수술 집게를 사용하여 산후 8 마우스의 눈꺼풀을 열고 한쪽 눈의 궤도에 곡면 미세 수술 포셉을 배치하여 안구를 압박하지 않고 시신경을 파악합니다. 집게로 안구를 부드럽게 당기고 제거하고 실온에서 4 %의 파라 포름알데히드로 눈을 고정시십시오.
30분 후 해부 현미경하에서 고정 안구를 얼음-차가운 PBS로 옮기고 50마이크로리터의 젤라틴 용액을 안구의 유리체 체내에 주입하여 림푸스 주변의 4개의 고르게 간격을 둔 부위에 주입한다. 그런 다음 얼음에 안구를 30분 동안 배양하여 유리체 공간 내에서 주입된 젤라틴을 고화시화합니다. 젤라틴이 해부 현미경하에서 PBS의 페트리 접시에 안구를 전달하고 미세 수술 가위를 사용하여 각막을 제거하기 위해 림푸스에서 절개를 합니다.
해부 현미경으로 시신경을 잘라내고 제거합니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 껍질을 벗기고 조각, 레티날 안료 상피 층을 버리고 홍채를 제거합니다. 망막의 시신경 측면이 위로 향하고 렌즈가 아래로 향하고, 젤라틴 유리체 몸과 망막 사이에 PBS의 축적을 허용하기 위해 망막 컵 바로 아래에 PBS의 50 마이크로 리터를 주입.
미세 수술 집게를 사용하여 유리체 몸에서 망막 컵과 섬모 체를 부드럽게 벗깁니다. PBS에 침지된 히알로이드 조직을 함유한 젤라틴 컵을 현미경 슬라이드로 이송파이프를 이체한다. 그리고 렌즈가 향하고 있도록 나머지 조직을 뒤집어.
그런 다음 렌즈를 들어 올리고 렌즈 튜니카 바스쿠로사 렌티스와 바사 히알로아이디어 프로프리아 사이의 연결을 부드럽게 느슨하게 한 후 미세 수술 가위로 히알로이드 동맥을 절단하여 렌즈 튜니카 바스쿠로사 렌티스를 제거합니다. 플랫 마운트용 히알로이드 컵의 바사 히알로이트 프로프리아 영역을 보관하십시오. hyaloid 용기 샘플의 평평한 장착을 위해 hyaloid 컵을 신선한 PBS로 부드럽게 헹구어 해부 파편을 제거합니다.
PBS에 떠있는 조직으로 부드럽게 배열하고 컵의 테두리가 아래로 향하고 있도록 젤라틴 히알로이드 컵의 위치를 조정하기 위해 미세 수술 집게를 사용합니다. PBS에 침지된 히알로이드 컵과 함께 슬라이드를 섭씨 37도의 슬라이드 워머에 놓습니다. 젤라틴이 녹은 후 히알로이드 플랫텐은 간신히 건조할 때 슬라이드를 제거하고 다피와 함께 페이드 장착 배지한 방울을 첨가하여 히알로이드 용기에 핵을 얼룩지게 한다.
그런 다음 히알로이드에 커버슬립을 부드럽게 놓아 플랫 마운트를 완성합니다. 히알로이드 용기의 DAPI 염색을 이미지화하기 위해 탑재된 샘플을 형광 현미경의 단계로 옮기고 중앙 히알로이드 동맥이 보이는지 확인한다. 그런 다음 hyaloid 동맥에서 직접 파생된 혈관 가지를 식별하고 정량화를 위해 선박 분기 수를 수동으로 계산합니다.
여기서, 3개월 된 야생형 및 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질 5 또는 LRP5 녹아웃 마우스, 지속적인 히알로이드 혈관을 가진 동물 모델인 망막 및 히알로이드 조직을 위한 OCT 이미지의 단면전이 도시되어 있다. 이러한 fundus 형광소 혈관에서 지속적인 히알로이드 혈관의 8가지 분지는 6주 된 녹아웃 마우스의 유리체 체내에서 관찰되며, 히알로이드 용기의 잔재는 같은 시대의 야생동물에서 관찰되지 않는다. 이러한 hyaloid 용기에서 플랫 마운트 혈관 세포 및 관련 대식세포는 핵 DAPI 염색에 의해 식별 될 수있다.
그리고 중앙 히알로이드 동맥에서 분기 세포의 각 라인은 vasa hyaloidea propria의 하나의 혈관을 나타냅니다. 야생형 마우스는 8일째산후산기에는 평균 12개의 히알로이드 혈관을 가지고 있으며, 연령일치LRP5 녹아웃 새끼는 효로이드 혈관의 회귀가 현저히 손상된 회귀를 보여주는 효노이드 혈관 의 약 25가지를 전시합니다. 또한 LRP5 녹아웃 새끼에서도 지연되고 불완전한 망막 혈관 발달이 관찰됩니다.
실제로, hyaloid 혈관은 아직도 산후 8일에 LRP5 녹아웃 눈 조직 단면의 단면에서 확인될 수 있습니다. 야생 형 눈은 더 이상 이러한 혈관을 표시하지 않는 반면. 기억해야 할 가장 중요한 것은 망막 및 기타 안구 조직에서 히알로이드 시스템을 분리할 때 부드럽고 인내심을 가지는 것입니다.
다른 세포 마커로 면역 염색하는 히알로이드 혈관을 분리한 후 히알로이드 회귀를 조절하는 세포 상호 작용을 밝히기 위해 수행될 수 있다. 이 기술은 안구 혈관 신생 연구에서 지속적인 태아 혈관의 기본 세포 및 분자 메커니즘을 탐구합니다. 파라포름알데히드, 케타민, 자일라진은 위험합니다.
적절한 개인 보호 장비를 사용하여 화학 연기 후드로 이러한 시약을 준비하십시오.
