Il nostro protocollo prevede misure sia in vivo che ex vivo per visualizzare e caratterizzare la vascolarizzazione ialoide all'interno dell'occhio come utile modello sperimentale per lo studio della regressione vascolare. Questa tecnica combina sia l'osservazione longitudinale in vivo dei vasi ialoidi nei topi vivi che la visualizzazione ex vivo e la quantificazione accurata di vasi ialoidi interi sezionati. La nostra tecnica fornisce un metodo pratico e fattibile per lo studio della patogenesi e dei meccanismi di base della vascucolatura fetale persistente.
Questo metodo fornisce anche informazioni sui meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella regolazione della regressione vascolare oculare che possono essere rilevanti per la ricerca sull'angiogenesi in altri organi. I passaggi di isolamento hyaloid possono essere tecnicamente impegnativi per i principianti. Molta pratica e pazienza aiuteranno a garantire una dissezione di successo.
La visualizzazione di questo metodo fornirà informazioni pratiche dettagliate e suggerimenti sulla tecnica che possono aiutare gli spettatori a padroneggiare le competenze in modo più efficiente. Per la tomografia a coerenza ottica o l'imaging OCT, regolare il mouse e la sonda in modo che la testa del nervo ottico si trova al centro del campo visivo nell'immagine del fondo e regolare la messa a fuoco e l'angolo della linea indicata nel software di imaging OCT per rivelare i vasi ialoidi persistenti prima di ottenere immagini. Per l'imaging angiografico della fluoresceina fundus dei vasi ialoidi, regolare leggermente l'allineamento per posizionare la testa del nervo ottico al centro del campo visivo e cambiare il filtro del microscopio in un canale fluorescente verde.
Quindi concentrati sui vasi ialoidi persistenti e ottieni più immagini in postinjection uno, tre, cinque e 10 minuti per determinare il miglior punto di tempo per il rapporto segnale-sfondo per osservare i vasi. Per la dissezione e la visualizzazione dei vasi ialoidi ex vivo utilizzare le forcep di microchirurgia per aprire le palpebre di un topo postnatale day-eight e posizionare le forcep di microchirurgia curve sotto il globo nell'orbita di un occhio per afferrare il nervo ottico senza spremere il bulbo oculare. Tirare delicatamente e rimuovere il bulbo oculare con le forcep e fissare l'occhio in paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente.
Dopo 30 minuti trasferire i bulbi oculari fissi in PBS ghiacciato sotto un microscopio a dissezione e iniettare 50 microlitri di soluzione di gelatina nel corpo vitreo del bulbo oculare in quattro diversi siti uniformemente distanziati intorno al limbo. Quindi incubare il bulbo oculare sul ghiaccio per 30 minuti per solidificare la gelatina iniettata all'interno dello spazio vitreo. Quando la gelatina è guarita trasferire il bulbo oculare in una piastra di Petri di PBS al microscopio di sezionazione e utilizzare forbici microchirurgia per fare un'incisione al limbo per rimuovere la cornea.
Tagliare e rimuovere il nervo ottico al microscopio di sezionazione. Usando due paia di forcep si staccano e scartano gli strati di epitelio di sclera, coroide e pigmento retinico, seguiti dalla rimozione dell'iride. Con il lato del nervo ottico della retina rivolto verso l'alto e le lenti rivolte verso il basso, iniettare 50 microlitri di PBS appena sotto la tazza di retina per consentire l'accumulo del PBS tra il corpo vitreo gelatinizzato e la retina.
Utilizzare le forcep di microchirurgia per sbucciare delicatamente la tazza di retina e il corpo ciliario dal corpo vitreo. Utilizzando una pipetta di trasferimento trasferire la tazza di gelatina contenente il tessuto ialoide immerso in PBS in uno scivolo al microscopio. E capovolgiamo i tessuti rimanenti in modo che l'obiettivo sia rivolto verso l'alto.
Quindi sollevare la lente e allentare delicatamente la connessione tra la lente tunica vasculosa lentis e la vasa hyaloidea propria prima di tagliare l'arteria ialoide con le forbici microchirurgia per rimuovere la lente tunica vasculosa lentis. Mantenere la regione vasa hyaloidea propria della tazza ialoide per il supporto piatto. Per il montaggio piatto dei campioni di vasi ialoidi sciacquare delicatamente la tazza ialoide con PBS fresco per rimuovere eventuali detriti di dissezione.
Con il tessuto che galleggia in PBS utilizzare forcelle di microchirurgia per disporre delicatamente e regolare la posizione della tazza ialoide gelatinizzata in modo che il bordo della tazza sia rivolto verso il basso. Posizionare lo scivolo con la tazza ialoide immersa in PBS su uno scaldascivole a 37 gradi Celsius. Dopo che la gelatina si scioglie e gli appiattimenti ialoidi rimuovono lo scivolo quando è appena asciutto e aggiungono una goccia di mezzo di montaggio anti-dissolvenza con DAPI per macchiare i nuclei nei vasi ialoidi.
Quindi posizionare delicatamente un coverslip sull'ialoide per completare il supporto piatto. Per immagini la colorazione DAPI dei vasi ialoidi trasferire il campione montato sullo stadio di un microscopio fluorescente e confermare che l'arteria ialoide centrale è visibile. Quindi identificare i rami del vaso direttamente derivati dall'arteria ialoide e contare manualmente il numero di rami del vaso per la quantificazione.
Qui, vengono mostrate viste trasversali delle immagini degli OCT per i tessuti retina e ialoidi di tipo selvatico di tre mesi e proteine correlate al recettore della lipoproteina a bassa densità cinque o topi knockout LRP5, un modello animale con vasi ialoidi persistenti. In questi fundus fluorescein immagini di vasi ialoidi persistenti si osservano otto rami di vasi ialoidi nel corpo vitreo di topi knockout di sei settimane mentre nessun residuo dei vasi ialoidi è osservato in animali di tipo selvatico della stessa età. In questi recipienti ialoidi piatti montano le cellule vascolari e i macrofagi associati possono essere identificati dalla loro colorazione NUCLEARE DAPI.
E ogni linea di cellule che si ramificano dall'arteria ialoide centrale rappresenta un vaso di vasa hyaloidea propria. I topi di tipo selvatico hanno una media di 12 rami di vasi ialoidi all'ottavo giorno postnatale, mentre i cuccioli knockout LRP5 abbinati all'età mostrano circa 25 rami di vasi ialoidi che dimostrano una regressione significativamente compromessa della vascucolatura ialoide. Inoltre, lo sviluppo vascolare della retina ritardata e incompleta si osserva anche nei cuccioli knockout LRP5.
In effetti, i vasi ialoidi possono ancora essere identificati nelle sezioni trasversali delle sezioni del tessuto oculare knockout LRP5 all'ottavo giorno postnatale. Mentre gli occhi di tipo selvaggio non mostrano più questi vasi. La cosa più importante da ricordare è essere gentili e pazienti quando si isola il sistema ialoide dalla retina e da altri tessuti oculari.
Dopo aver isolato i vasi ialoidi, è possibile eseguire l'immunosocienza con diversi marcatori cellulari per scoprire le interazioni cellulari che regolano la regressione ialoide. Questa tecnica esplora i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti della vascolarizzazione fetale persistente nella ricerca sull'angiogenesi oculare. Paraformaldeide, ketamina e xiazina sono pericolosi.
Si prega di preparare questi reagenti in una cappa aspirante chimica utilizzando i dispositivi di protezione individuale adeguati.
