Notre protocole fournit à la fois des mesures in vivo et ex vivo pour visualiser et caractériser la vascularisation hyaloïde dans l’œil comme un modèle expérimental utile pour étudier la régression vasculaire. Cette technique combine à la fois l’observation longitudinale in vivo des vaisseaux hyaloïdes chez les souris vivantes et la visualisation ex vivo et la quantification précise des vaisseaux hyaloïdes entiers disséqués. Notre technique fournit une méthode pratique et faisable pour étudier la pathogénie et les mécanismes de base de la vascularisation foetale persistante.
Cette méthode fournit également un aperçu des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la régression vasculaire oculaire qui peut être pertinente pour la recherche d’angiogenèse dans d’autres organes. Les étapes d’isolement hyaloïde peuvent être techniquement difficiles pour les débutants. Beaucoup de pratique et de patience aideront à assurer une dissection réussie.
La visualisation de cette méthode fournira des informations pratiques détaillées et des conseils sur la technique qui peut aider les téléspectateurs à maîtriser les compétences plus efficacement. Pour la tomographie par cohérence optique ou l’imagerie OCT, ajustez la souris et la sonde de sorte que la tête du nerf optique soit au centre du champ visuel dans l’image du fond et ajustez la mise au point et l’angle de la ligne indiquée dans le logiciel d’imagerie OCT pour révéler les vaisseaux hyaloïdes persistants avant d’obtenir des images. Pour l’imagerie angiographie par fluoréscéine fundus des vaisseaux hyaloïdes, ajustez légèrement l’alignement pour positionner la tête du nerf optique au centre du champ de vision et changez le filtre microscope en canal fluorescent vert.
Ensuite, concentrez-vous sur les vaisseaux hyaloïdes persistants et obtenez plusieurs images à un, trois, cinq et 10 minutes après l’injection pour déterminer le meilleur point de temps pour le rapport signal-arrière-plan pour l’observation des navires. Pour la dissection et la visualisation des vaisseaux hyaloïdes ex vivo, utilisez des forceps de microchirurgie pour ouvrir les paupières d’une souris postnatale du jour huit et placer des forceps de microchirurgie incurvés sous le globe dans l’orbite d’un œil pour saisir le nerf optique sans presser le globe oculaire. Tirez doucement et retirez le globe oculaire avec des forceps et fixez l’oeil dans le paraformaldéhyde de 4% à la température ambiante.
Après 30 minutes, transférer les globes oculaires fixes au PBS glacé au microscope à dissection et injecter 50 microlitres de solution gélatineuse dans le corps vitreux du globe oculaire à quatre sites uniformément espacés autour du limbe. Puis incuber le globe oculaire sur la glace pendant 30 minutes pour solidifier la gélatine injectée dans l’espace vitreux. Lorsque la gélatine a guéri transférer le globe oculaire à une boîte de Pétri de PBS sous le microscope dissection et utiliser des ciseaux de microchirurgie pour faire une incision à limbus pour enlever la cornée.
Pincez et retirez le nerf optique sous le microscope disséquant. À l’aide de deux paires de forceps décoller et jeter les couches d’épithélium pigmentaire sclera, choroïde et rétinien, suivie de l’ablation de l’iris. Avec le côté nerveux optique de la rétine face vers le haut et les lentilles orientées vers le bas, injecter 50 microlitres de PBS juste sous la tasse de rétine pour permettre l’accumulation de la PBS entre le corps vitreux gélatineux et la rétine.
Utilisez des forceps de microchirurgie pour peler doucement la tasse de rétine et le corps ciliaire du corps vitreux. À l’aide d’un pipet de transfert, transférer la tasse de gélatine contenant le tissu hyaloïde immergé dans le PBS à une lame de microscope. Et retournez les tissus restants de sorte que la lentille est orientée vers le haut.
Soulevez ensuite la lentille et relâchez doucement la connexion entre la lentille tunica vasculosa lentis et la vasa hyaloidea propria avant de couper l’artère hyaloïde avec les ciseaux de microchirurgie pour enlever la lentille tunica vasculosa lentis. Gardez la vasa hyaloidea propria région de la tasse hyaloïde pour la monture plate. Pour le montage plat des échantillons de récipient hyaloïde rincer doucement la tasse hyaloid avec PBS frais pour enlever tous les débris de dissection.
Avec le tissu flottant dans PBS utiliser des forceps de microchirurgie pour arranger doucement et ajuster la position de la tasse hyaloïde gélatineuse de sorte que le bord de la tasse est orienté vers le bas. Placez la toboggan avec la tasse hyaloïde immergée dans le PBS sur un chauffe-glissière à 37 degrés Celsius. Après la fonte de la gélatine et l’aplatissement hyaloïde enlever la lame quand il est à peine sec et ajouter une goutte de milieu de montage anti-fondu avec DAPI pour tacher les noyaux dans les vaisseaux hyaloïdes.
Ensuite, placez doucement un coverslip sur l’hyaloïde pour compléter la monture plate. Pour imager la coloration DAPI des vaisseaux hyaloïdes transférer l’échantillon monté sur le stade d’un microscope fluorescent et confirmer que l’artère hyaloïde centrale est visible. Identifiez ensuite les branches du navire directement dérivées de l’artère hyaloïde et comptez manuellement le nombre de branches de navires à quantifier.
Ici, des vues transversales des images d’OCT pour la rétine et les tissus hyaloïdes dans le type sauvage de trois mois et la protéine récepteur de lipoprotéine de basse densité cinq ou souris de KO de LRP5, un modèle animal avec des vaisseaux hyaloïdes persistants, sont montrées. Dans ces images d’angiographie de fluorescéine de fundus des vaisseaux hyaloïdes persistants huit branches des vaisseaux hyaloïdes sont observées dans le corps vitreux des souris de KO de six semaines tandis qu’aucun reste des vaisseaux hyaloïdes n’est observé chez les animaux sauvages de type du même âge. Dans ces vaisseaux hyaloïdes, les montures plates des cellules vasculaires et des macrophages associés peuvent être identifiés par leur coloration nucléaire DAPI.
Et chaque ligne de cellules ramissant de l’artère hyaloïde centrale représente un vaisseau de vasa hyaloidea propria. Les souris sauvages de type ont en moyenne 12 branches de vaisseaux hyaloïdes au huitième jour postnatal, tandis que les chiots KO LRP5 appariés par âge présentent environ 25 branches de vaisseaux hyaloïdes démontrant une régression significativement altérée de la vascularisation hyaloïde. En outre, le développement vasculaire retardé et incomplet de rétine est également observé dans les chiots de KO de LRP5.
En effet, les vaisseaux hyaloïdes peuvent encore être identifiés dans les sections transversales des sections de tissu oculaire par KO LRP5 au huitième jour postnatal. Alors que les yeux de type sauvage n’affichent plus ces vaisseaux. La chose la plus importante à retenir est d’être doux et patient lors de l’isolement du système hyaloïde de la rétine et d’autres tissus oculaires.
Après isoler les vaisseaux hyaloïdes immunostaining avec différents marqueurs cellulaires peuvent être effectués pour découvrir les interactions cellulaires régulant la régression hyaloïde. Cette technique explore les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents de la vascularisation foetale persistante dans la recherche oculaire d’angiogenèse. Le paraformaldéhyde, la kétamine et la xylazine sont dangereux.
S’il vous plaît préparer ces reagents dans un capot de fumée chimique en utilisant l’équipement de protection individuelle approprié.
