Nuestro protocolo proporciona medidas in vivo y ex vivo para visualizar y caracterizar la vasculatura hialoides dentro del ojo como un modelo experimental útil para estudiar la regresión vascular. Esta técnica combina tanto la observación longitudinal in vivo de los vasos hialoides en ratones vivos como la visualización ex vivo y la cuantificación precisa de los vasos hialoides enteros diseccionados. Nuestra técnica proporciona un método práctico y factible para el estudio de la patogénesis y los mecanismos básicos de la vasculatura fetal persistente.
Este método también proporciona información sobre los mecanismos celulares y moleculares implicados en la regulación de la regresión vascular ocular que puede ser relevante para la investigación de la angiogénesis en otros órganos. Los pasos de aislamiento hialoides pueden ser técnicamente desafiantes para los principiantes. Mucha práctica y paciencia ayudarán a asegurar una disección exitosa.
Visualizar este método proporcionará información práctica detallada y consejos sobre la técnica que pueden ayudar a los espectadores a dominar las habilidades de manera más eficiente. Para la tomografía de coherencia óptica o la imagen de OCT, ajuste el ratón y la sonda de modo que la cabeza del nervio óptico esté en el centro del campo visual en la imagen del fondo y ajuste el enfoque y el ángulo de la línea indicada en el software de imágenes OCT para revelar los vasos hialoides persistentes antes de obtener imágenes. Para la angiografía de fluoresceína fundus de los vasos hialoides, ajuste la alineación ligeramente para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro del campo de visión y cambie el filtro del microscopio a un canal fluorescente verde.
A continuación, concéntrese en los vasos hialoides persistentes y obtenga varias imágenes en uno, tres, cinco y 10 minutos de postinyección para determinar el mejor punto de tiempo para la relación señal-fondo para observar los vasos. Para la disección y visualización de recipientes hialoides ex vivo, utilice fórceps de microcirugía para abrir los párpados de un ratón postnatal de ocho días y coloque fórceps de microcirugía curvadas debajo del globo en la órbita de un ojo para agarrar el nervio óptico sin apretar el globo ocular. Tire suavemente y retire el globo ocular con fórceps y fije el ojo en 4%paraformaldehído a temperatura ambiente.
Después de 30 minutos transferir los globos oculares fijos a PBS helado bajo un microscopio de disección e inyectar 50 microlitros de solución de gelatina en el cuerpo vítreo del globo ocular en cuatro sitios separados uniformemente diferentes alrededor del limbo. Luego incubar el globo ocular sobre hielo durante 30 minutos para solidificar la gelatina inyectada dentro del espacio vítreo. Cuando la gelatina se haya curado, transfiera el globo ocular a un plato de Petri de PBS bajo el microscopio diseccionador y utilice tijeras de microcirugía para hacer una incisión en el limbo para eliminar la córnea.
Cortar y extraer el nervio óptico bajo el microscopio de disección. Usando dos pares de fórceps pelar y desechar las capas de epitelio de pigmento esclero, coroides y de la retina, seguido de la eliminación del iris. Con el lado del nervio óptico de la retina hacia arriba y las lentes hacia abajo, inyecta 50 microlitros de PBS justo debajo de la copa de la retina para permitir la acumulación del PBS entre el cuerpo vítreo gelatinizado y la retina.
Usa fórceps de microcirugía para pelar suavemente la copa de la retina y el cuerpo ciliar del cuerpo vítreo. Mediante una pipeta de transferencia, transfiera la copa de gelatina que contiene el tejido hialoides sumergido en PBS a un portaobjetos. Y gire los tejidos restantes para que la lente esté mirando hacia arriba.
A continuación, levante la lente y afloje suavemente la conexión entre la lente tunica vasculosa lentis y la vasa hyaloidea propria antes de cortar la arteria hialoid con las tijeras de microcirugía para eliminar la lente tunica vasculosa lentis. Conservar la región vasa hyaloidea propria de la copa hialoides para el montaje plano. Para el montaje plano de las muestras del recipiente hialoides enjuague suavemente la copa hialoides con PBS fresco para eliminar cualquier residura de disección.
Con el tejido flotando en PBS utilizar fórceps de microcirugía para organizar suavemente y ajustar la posición de la copa hialoides gelatinizada de modo que el borde de la copa está mirando hacia abajo. Coloque el portaobjetos con la copa hialoides sumergida en PBS en un calentador de diapositivas a 37 grados Centígrados. Después de que la gelatina se derrite y los aplanamientos hialoides retiran el deslizamiento cuando apenas está seco y añaden una gota de medio de montaje anti-fade con DAPI para manchar los núcleos en los vasos hialoides.
A continuación, coloque suavemente un cubreobjetos en el hialoides para completar el soporte plano. Para imaginar la tinción DAPI de los vasos hialoides, transfiera la muestra montada a la etapa de un microscopio fluorescente y confirme que la arteria hialoides central es visible. A continuación, identifique las ramas del vaso directamente derivadas de la arteria hialoides y cuente manualmente el número de ramas de los vasos para la cuantificación.
Aquí, se muestran vistas transversales de imágenes DE OCT para la retina y los tejidos hialoides en un tipo salvaje de tres meses de edad y proteína relacionada con receptores de lipoproteínas de baja densidad cinco o ratones noqueadores LRP5, un modelo animal con vasos hialoides persistentes. En estas angiografías de fluoresceína de fundente de vasos hialoides persistentes se observan ocho ramas de vasos hialoides en el cuerpo vítreo de ratones nocaut de seis semanas de edad, mientras que no se observa ningún remanente de los vasos hialoides en animales de tipo salvaje de la misma edad. En estos montajes planos de recipientes hialoides, las células vasculares y los macrófagos asociados pueden ser identificados por su tinción nuclear DAPI.
Y cada línea de células que se ramifican de la arteria hialoid central representa un vaso de vasa hyaloidea propria. Los ratones de tipo salvaje tienen un promedio de 12 ramas de vasos hialoides en el día ocho postnatal, mientras que los cachorros de LRP5 que coinciden con la edad exhiben alrededor de 25 ramas de vasos hialoides que demuestran una regresión significativamente deteriorada de la vasculatura hialoides. Además, el desarrollo vascular de la retina retardado e incompleto también se observa en los cachorros de nocaut LRP5.
De hecho, los vasos hialoides todavía se pueden identificar en secciones transversales de las secciones de tejido ocular knockout LRP5 en el día ocho postnatal. Mientras que los ojos de tipo salvaje ya no muestran estos vasos. Lo más importante a recordar es ser suave y paciente al aislar el sistema hialoides de la retina y otros tejidos oculares.
Después de aislar los vasos hialoides se puede realizar inmunomancha con diferentes marcadores celulares para descubrir las interacciones celulares que regulan la regresión hiloide. Esta técnica explora los mecanismos celulares y moleculares subyacentes de la vasculatura fetal persistente en la investigación de la angiogénesis ocular. Paraformaldehído, ketamina y xilazina son peligrosos.
Por favor, prepare estos reactivos en una campana química utilizando el equipo de protección personal adecuado.
