この方法は、中足骨培養プロトコルを大きな骨に適応させ、骨の発達に関連するプロセスに対処するために複雑な遺伝モデルと直接骨操作を組み合わせることを可能にする。この技術は、ライブイメージングや直接物理的および薬理学的操作など、生体内では不可能な骨の成長の操作と分析を可能にします。このex vivo培養法は、治療が生物に及ぼす全身的な影響からそれを分離する骨の遺伝的インセットの局所的な影響の特定の研究を可能にする。
妊娠14.5日目から18.5日のマウスの腹部領域を80%エタノールで殺菌し、小さなはさみを使って皮膚と腹筋を開いて子宮の角にアクセスすることから始めます。腹腔から子宮を抽出するには、メソムトリウムを取り除き、角の基部を切断する。次に、氷冷解離培地を含む60ミリメートルのシャーレに子宮を氷上に移します。
バイオセーフティキャビネットでは、個々の胎児を分離するためにはさみで袋の間を切断し、解剖ステレオ顕微鏡の下で新鮮な解剖媒体で新しい60ミリメートル皿に個々の袋を転送します。ピンセットを使用して胎盤から胎児を分離し、胎児を膜からきれいにする。トリミングされたプラスチック製のピペットを使用して、新しい60ミリメートル皿に体を移し、さらに解剖する前に胚を切断します。
その後、ピンセットを使用して皮膚を取り除き、背中から始めてつま先まで剥がします。ピンセットを使用して背骨の近くを切断し、後肢を体から分離します。後肢を氷冷解剖培地を含むきれいな皿に移し、遠位大腿骨の表面軟骨と近位脛骨の間にピンセットを挿入して脛骨と大腿骨を分離する。
脛骨から近位大腿骨と踵骨と脛骨から股関節の骨を取り除きます。慎重にニップと大腿骨と脛骨から柔らかい組織を引っ張り、無菌1ミリリットルピペットを使用して、新鮮な解剖媒体を含む24ウェルプレートの最初の井戸にすべての4本の脚の骨を移します。骨の脈拍を接続する軟部組織が除去されることを示することが重要である。
さもなければ、骨は曲がり、適切な成長を達成しない。骨が適切な実験数の胎児から解剖された場合、良好なコントラストを持つ光顕微鏡の下で時々ゼロで各井戸の骨を画像化し、骨を吸引しないように余分な注意を払って各井戸の解剖培地を1ミリリットルの培養培地に置き換えます。培養条件における成長阻害の効果を観察するには、500ナノモルレチノイン酸で左ティビアスを処理し、右側のチビアを同等の量の車両をコントロールとしてインキュベートします。
次いで、標準的な細胞培養条件下で細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。2日後、適切なチミジンアナログで骨を1〜2時間治療し、骨細胞増殖を評価してから、骨を4%パラホルムアルデヒドの個々の2ミリリットルチューブに10分間移す。次に、骨をPBSに移して最終時点で骨を画像化してから、サンプルをパラホルムアルデヒドに戻し、摂氏4度で一晩固定します。
骨の長さや鉱化領域を測定するには、適切なイメージングソフトウェアプログラムを開き、画像のスケールを考慮して、骨の全長と鉱化領域の両方を測定します。一方の端にある最初の暗い細胞から、もう一方の端にある最後の暗い細胞までの測定を開始します。1日あたりの平均増加長として定義される成長率を計算するには、骨の最終的な長さと初期の長さの差を培養日数で割ります。
ここでは、培養脛辺と抽出したばかりの脛刺との比較を同等の段階で示す。培養の最大2日後に達成されたサイズは、軟骨およびミネラル化された骨の両方の生体内の骨の成長に匹敵する。培養期間が長いと、培養された骨と抽出された骨の間に大きな違いが生じる。
なお、軟組織の不完全な除去で成長した脛脛は、培養された脛組織の曲げをもたらす可能性がある。レチノイン酸による治療は、2日間の治療の後、早くも脛犬の成長に強い影響を与えます。培養で2日後に脛脛の全長が一貫して増加するが、この成長は最初の長さからわずか9〜29%の概数の増加に相当する。
インビボで観察されるであろう骨の成長の増加よりも少ない.実際、チミジンアナログ標識は、同等の段階の新鮮な抽出された骨と比較して、培養後のこの領域の陽性細胞の数が少ない。また、インビトロ培養脛刺では、骨格元素の全長が実質的に増加し、一方で鉱化領域の増加はほとんど見られない。
組織学的および分子的解析に加えて、培養後のクリアリングおよび3Dイメージングを行い、培養骨に適用される治療の細胞効果を特徴付けることができる。この技術は、私たちが相互コミュニケーションに関連する質問に対処することを可能にします。例えば、何らかの痛みのないパラバイオシス実験で異なる遺伝モデルから骨を共同培養することによって。
