このプロトコルは、完全な腎臓の3次元構造の視覚化を可能にし、巨視的な視点を提供することにより、腎臓研究における革新的な発見につながる可能性があります。ホールマウント臓器染色は、抗体の浸透が難しいため困難です。このプロトコルは、抗体による腎臓の高品質でホールマウント染色を実証しています。
まず、灌流固定と腎臓サンプリングの直後に、腎臓を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で16時間浸漬して浸漬固定を行います。PBSを使用してそれぞれ2時間3回洗浄します。固定した腎臓を7ミリの50%CUBIC-Lに14ミリリットルの丸底チューブに浸し、室温で穏やかに振とうして脱色および脱脂プロセスを実行します。
6時間後、14ミリメートルの丸底チューブに入った7ミリリットルのCUBIC-Lに腎臓を浸し、摂氏37度で5日間穏やかに振とうします。キュービック-Lを毎日リフレッシュしてください。脱色と脱脂が完了したら、サンプル処理にディスペンシングスプーンを使用し、腎臓をPBSで室温で2時間3回洗浄します。
脱脂した腎臓を染色バッファー溶液で希釈した一次抗体で免疫染色し、摂氏37度のインキュベーターシェーカーで7日間穏やかに振とうします。次に、PBSTとしても知られるPBS中の0.5%Triton X-100で腎臓を室温で1日間洗浄します。二次抗体染色の場合は、腎臓を染色バッファー中の二次抗体で、暗所で、摂氏37度で7日間穏やかに振とうして処理します。
PBST洗浄で室温で1日染色を修正します。固定後、腎臓をPB中の1%ホルムアルデヒドに3時間浸し、PBSで室温で6時間洗浄します。14ミリリットルの丸底チューブに7ミリリットルの50%CUBIC-R+に腎臓を1日振とうした後、7ミリリットルのCUBIC-R+で室温で2日間振とうして治療し、屈折率マッチングを行います。
免疫染色法の助けを借りて、腎臓全体の交感神経と動脈を3D腎臓イメージングで視覚化しました。また,虚血再灌流障害後の腎交感神経異常を可視化した。このプロトコルはまた、脾臓全体の交感神経の視覚化を容易にしました。
3次元免疫蛍光染色のためのデータ定量処理をここに表示した。さらに、集合管、近位尿細管のS1セグメント、および糸球体は、腎臓全体で首尾よく視覚化されました。糖尿病性腎疾患の初期段階での薬物投与に起因する糸球体腫大の抑制も、3Dイメージングで視覚化されました。
このプロトコルは、腎臓全体の特定の分子を標識することができます。したがって、研究者は血管系の構造変化を分析したり、腎臓組織のまれなイベントを見つけることができます。
