本稿では、細胞間の位置づけや組成の研究に用いられる画像化と生化学的手法、ならびに免疫シナプスの形成中に観察された細胞骨格の再調整について議論する。アクティブリモデリングの初期段階では、B細胞は細胞表面を増加させ、シナプスに集めた抗原BCR複合体の量を最大化することができます。一方、リソソームの局所的な動員は、シナプス膜における中心と共に、固定化された抗原の抽出を容易にすることが知られているリソソーム分泌物に結合することができる。
取り込まれた抗原は、エンドリソソーム内でさらにペプチドに処理され、Tヘルパー細胞に提示するためにMHCクラスII分子にロードされます。したがって、免疫シナプスに関連するオルガネラダイナミクスを研究することは、B細胞がどのように完全に活性化されているかを理解するために重要です。固定化された抗原で活性化されたB細胞の免疫蛍光は、異なる細胞成分と免疫シナプスにどのようにしてリクルートできるかを可能にします。
B細胞は、ビーズ表面またはカバースリップ表面で固定化された抗原を介して活性化することができる。抗原コーティングビーズは、以前グルタルアルデヒドで処理されたアミノビーズで特異的リガンドをインキュベートして、アミノ基を活性化することによって調製される。PBSと渦の100マイクロリットルで活性ビーズを再懸濁します。
一方、150マイクロリットルのPBSにBCRリガンドのmL当たり100マイクログラムを加えて抗原溶液を調製した。次に、活性化ビーズ50マイクロリットルを抗原溶液に加え、摂氏4度で一晩インキュベートする。また、負のコントロールとして無関係のリガンドを使用してください。
インキュベーション後、PBSでビーズを洗浄します。上清を吸引し、PBSに置き換えます。3 回繰り返します。
次に、BSAの溶液の500マイクロリットルでビーズを再懸濁して3つのアミノ基をブロックする。最後に、70マイクロリットルのPBSでビーズを再懸濁します。最終的な濃度を計算するには、ヘモサイトメーターを使用してビーズを数えることができます。
B細胞活性化のために、50 mLチューブを使用し、5%の牛胎児血清を補充したクリックでmLあたり150万の濃度に細胞を再中断します。次に、150,000 B細胞を加え、100マイクロリットルの細胞ビーズ混合物をポリL-リジンコーティングカバースリップの塗布を37度で異なる時間ポイントでインキュベートする。B細胞を活性化する第2のアプローチは、それらを抗原コーティングされたカバースリップに播種することです。
この目的のために、抗BCRおよびB220とのコートスライドは細胞の接着を改善する。抗原溶液をPBSに添加して、それぞれ1mL当たり10マイクログラム、mL当たり0.5マイクログラムの最終濃度にします。次に、パラフィルムフィルムで覆われた24のウェルプレートの蓋の上にカバースリップをセットし、40マイクロリットルの抗原溶液を加えます。
プレートを密封し、一晩4度でインキュベートします。カバースリップでアクティベーションを開始するには、まずPBSで洗浄し、数分間乾燥させます。次に、150,000 B細胞を加え、異なる時間ポイントに対して37度でインキュベートします。
いずれの場合も、ビーズまたは抗原コーティングスライドのいずれかで活性化する場合は、最も長いタイムポイントから始めて、短いタイムポイントに進むのがおすすめです。ドライカバースリップを顕微鏡スライドに取り付けたら、分解能の要件に応じて、蛍光または共焦点顕微鏡を使用してサンプルを表示できます。透過光を使用してサンプルを焦点を合わせます。
セルとビーズが 1 つの比率で相互作用しているフィールドを検索する必要があります。抗原で覆われたカバーリップ上で活性化されたB細胞の場合、より良い解像度のために100xの目的を使用してください。パラメーターの場合は、セル全体をカバーする z スタックを使用することを検討してください。
セルの下側境界と上側境界を区切るために、アクチンにラベルを付けることができます。抗原被覆ビーズで活性化されたB細胞の場合、1点に閉じ込められたオルガネラにラベルを付ける場合、まず細胞領域とビーズ領域の2つの領域を区切ります。次に、ポイントによって位置またはオルガネラを特定し、そのローカリゼーション座標を取得します。
2 つのベクトルを描画します:1 つはセルの中心とオルガネラの間、もう 1 つはセルの中心とビーズの中心の間に描画します。両方の長さを測定し、アルファと呼ばれる 2 つのベクトル間の角度を測定します。アルファのグアシアンを使用して中心と細胞の中心の間のベクトルを使用して投影を行い、投影されたベクトルaをbで割ってオルガネラの極性指数を計算します。
したがって、ゼロと1の間の極性指数は偏波表現型を示す。0 からマイナス 1 の間の値は、非偏波表現型を示します。リソソームのようなより分散したオルガネラの極性指数を決定するために、前に述べたアルゴリズムと同じアルゴリズムを使用して、ラベルの質量中心の座標(この場合はリソソーム)のオルガネラ局所座標を変更することができます。
前述の分析と同様に、ゼロと1の間の極性指数は偏波表現型を示し、一方、ゼロとマイナス1の間の値は非偏波表現型を示す。新しいシナプスに密接にリクルートされた各オルガネラの量を定量化するために、ビーズにおけるオルガネラ蛍光の割合を計算することができます。このためには、ビーズと細胞領域を区切り、それぞれの蛍光強度を測定し、ビーズと細胞の蛍光の合計でビーズを除算する必要があります。
新しいシナプスに接触している各オルガネラの量を取得します。または、ビードの反対側に長方形を描画します。細胞長の4分の1に相当する重量を使用し、長方形内の蛍光強度を測定し、それを全蛍光で割ります。
このアルゴリズムは、常に新しいシナプスに密接であるオルガネラの割合を取得しますが、必ずしもインターフェースと直接接触するとは限りません。安静および活性化されたB細胞におけるセントロソーム関連成分を定量化する。簡単に言えば、3つのパラメータを決定します。
セルとビーズの領域、および中心の局所化座標。次に、中心を囲む円を定義し、前に定義したセントロソームの中心から放射状プロファイル解析を実行します。プロットを作成したら、最大蛍光の70%が維持される半径を決定します。
この半径を使用して、中心を囲む円を描きます。最後に、対象成分の蛍光密度を中心領域と細胞領域で取得し、両方の値を分割して蛍光密度比を求める。免疫シナプス界面でのオルガネラの分布を測定するために、まず抗原被覆と接触しているB細胞の領域を同定する。
この領域を定義しやすくするために、アクチンにラベルを付けることができます。次に、スライドと接触する領域、セルの高さおよび幅を測定します。抗原被覆スリップに面した領域は、B細胞活性化時に広がるB細胞の測定である。
セルの中央領域を、境界から高さおよび幅の 4 分の 1 で区切って区切る場合は、高さと幅の値を使用します。通常これらは、セル面積の約3分の1に相当する。最後に、新シナプスの中心でのオルガネラの集生を計算し、中央領域の蛍光密度を全細胞の蛍光密度で割る。
この指標の正の値は、新しいシナプスの中心にあるオルガネラの濃縮を示す。反対に、負の値は周辺分布を示します。抗原被覆カバーリップ上で活性化されたB細胞のZプレーン全体のオルガネラの分布を測定するには、まずシナプス界面と細胞の上限を区切る。
次に、セルの中心を横切って線を引き、画像を再スライスして XZ イメージを取得します。細胞の頭部を測定し、同じ領域の10画分に、免疫シナプスから細胞の上限まで分割する。各z分画の蛍光を測定し、各z分数の蛍光を細胞の全蛍光で割って蛍光の割合を計算します。
最後に、z分数あたりの蛍光強度の割合をプロットします。分数 1 と 2 はシナプス インターフェイスを表します。ワークフローまたはセントロソー分離手順を次に示します。
条件ごとに 2,000 万個の B セルを使用します。細胞を細胞の前処理 D およびノコダゾールセントロソーム剥離を促進するために必要なプロトコルに従って.次に、5 mLのTBSバッファーに再懸濁して細胞を見る。
8%スクロースを補った0.1x TBSバッファーの1 mLを使用して繰り返します。細胞ペレットを150マイクロリットルのリシスバッファーで再懸濁します。遠心分離機は、細胞質とオルガネラを核から分離するために摂氏4度で10分間10分間10、000gで遠心分離する。
慎重に細胞上清を回収し、1.5 mLチューブの上に置きます。60%スクロースを補った300マイクロリットルの勾配バッファーでそれを埋めます。摂氏4度で30分間10,000gの遠心分離機サンプル。
この遠心分離工程は、遠心分離体を濃縮するために重要である。遠心分離後、インターフェイスに到達するまで上清を慎重に取り出します。チューブに残っているサンプルを渦。
0.45 mLの70%スクロース、50%スクロースの0.27 mL、勾配バッファー内の40%スクロースの0.27 mLを重ね合わせ、超遠心分離管で不連続なスクロース勾配を準備します。不連続勾配にセントロソーム濃縮サンプルを配置し、各アダプタの各サンプルの重量を較正します。40,000 gのチューブを摂氏4度で1時間遠心し、最低加速度で、勾配を乱さないように休憩を加えます。
遠心分離後、同じ体積で12分を慎重に収集します。読み込みバッファーを使用してサンプルを再中断し、SDS-PAGE を実行します。免疫シナプスの形成中のB細胞における細胞小器官分布を研究するために、我々は異なる時点で抗原コーティングビーズで活性化された2A1.6 B細胞を用いた。
コントロールとして、B細胞は無関係なBCRリガンドを含むビーズで活性化した。その後、免疫蛍光染色を用いて、固定化された抗原で活性化すると局所化を変化させる異なるオルガネラを検出する。ここでは、Rab6aでラベル付けされたアルファチューブリンとゴルジ装置で標識されたセントロソームを示しています。
グラフでは、各ドットが1つのセルを表す、活性化の各時点における中心およびゴルジ装置の極性の極性指数を示す。活性化の間、これらのオルガネラの極性指数が1に近い値に達することを観察することができ、リソソームのようなより分散した分布を示すIS.Organellesへの採用の増加も極性指数を使用して定量化することができる。我々は、ライオソームの極性指数が活性化時により正の値に達することを観察することができ、これはISへの採用から生じる。免疫シナプスに対するリソソームの採用を定量化するための補完的なアプローチを示す。
抗原被覆ビーズとの活性化の同じプロトコルを用いて、ISへのリソソーム募集は、ビーズの周囲またはシナプス領域内で定義された領域に採用されたリヨソームの蛍光ラベルを定量化することによって計算した。私たちは、そのオープンアクティベーションを観察することができます。シナプスの部位に結合リソソームの増加があります。.
ここでは、特異的および非特異的抗原被覆ビーズで活性化されたB細胞中の中心でのアクチンの定量化を提示する。アクチンのプールは矢印で示されます。この場合のアクチンなどのセントロソーム関連成分の定量化は、ドットプロットで表され、各ドットは1つのセルを表します。
活性化後、B細胞は中心系の周りのアクチンの量が減少する。このステップは、新しいシナプスへの分極を可能にするために、核外領域からセントロソームを切り離すために重要である。抗原被覆表面で活性化されたB細胞については、アクチンリモデリングやシナプス膜へのオルガネラの採用を研究することができます。
ここでは、ゴルジ装置や小胞子などの小器官の分析を示し、それぞれ中央分布と末梢分布を示す。さらに、活性化の異なる時点の後にB細胞の広がる領域を計算することができます。このため、アクチンにラベルを付けて、XY平面のセル制限を定義できるようにしています。
グラフでは、活性化の30分と60分後にセル領域の増加を観察することができます。オルガネラの分布は、シナプス界面にそれぞれXZ平面で計算することもできる。グラフは、最初の 2 つの平面がシナプス界面に対応する z 平面におけるアクチンの分布を表します。
アクチンが活性化するとこの領域が豊かになることを観察することができます。イメージング解析に加えて、生化学的アプローチは、B細胞活性化時のセントロソーム組成物の変化を研究するためにも使用することができる。ここでは、ベージュの長方形で強調されたセントロソーム含有分率の代表的な西洋のブロットを示します。
セントロソーム画分は、不連続なスクロース勾配で単離され、ガンマチューブリンレベリングによって検出された。下のウェスタンブロットは、活性化時に枯渇するB細胞を休ませる中等分でアクチンとArp2を示しています。Bリンパ球は、機能的免疫シナプスを形成するために膜界面で動的変化を起こします。
このプロセスは、このビデオでここで説明するイメージングおよび生化学的手法によって研究することができます。この解析は、B細胞がどのように効率的に活性化できるかに関する分子メカニズムに関する価値情報を提供できると考えています。
