Гибридизация на месте является очень информативным методом представления моделей экспрессии мРНК и инкРНК конкретных генов в тканях. Наша цель в этой статье заключается в разработке чувствительного метода для обнаружения конкретной локализации мРНК в копомической жидкости Sipunculus nudus, который является важнейшим ресурсом рыболовства. Мы представили репрезентативные результаты, полученные в результате наших успешных экспериментов с использованием этого метода.
Есть надежда, что наш метод будет применяться к другим видам сипункулы для выявления экспрессии моделей конкретной мРНК и инкРНК в копомической жидкости. Закрепить sipunculus nudus на столе для вскрытия. Откройте корпус Sipunculus nudus небольшими автоматическими ножницами.
Затем соберите и перенесите келомную жидкость с пипеткой на поли-D-лизин обработанные микроскопом слайды, равномерно распределив их. Воздух-сухие горки в течение часа при 37 градусов по Цельсию. Вымойте горки с DEPC-PBS в течение трех раз, пять минут за стирку с нежным возбуждением.
Слейте pbs, добавьте раствор протеиназы K на слайдах в течение пяти минут при комнатной температуре. Слейте раствор протеиназы K. Добавьте раствор PFA на слайдах в течение 20 минут при комнатной температуре.
Слейте решение PFA. Вымойте горки с DEPC-PBS в течение трех раз, пять минут за стирку с нежным возбуждением. Слейте воду PBS.
Добавьте 50 микролитров рибопробе. Добавьте обложку. Положите слайды во влажную коробку и хорошо запечатать парафиновой пленкой.
Гибридизировать ночь при 60 градусах по Цельсию. Погрузите слайды в буфер стирки и дайте ему стоять до тех пор, пока крышки не соскальзывают автоматически. Вымойте горки с разогретым буфером мытья в течение двух раз при 65 градусов по Цельсию, 30 минут на стирку с нежным возбуждением.
Вымойте горки с разогретым раствором SSC два раза при 65 градусах Цельсия, 30 минут на стирку с нежным возбуждением. Вымойте горки раствором MABT два раза при комнатной температуре. 30 минут за стирку с нежным возбуждением.
Слейте MABT. Добавьте блокирующий буфер. Инкубировать горки при комнатной температуре в течение трех-четырех часов.
Слейте блокирующий буфер. Добавить антитела, инкубировать слайды при четырех градусах по Цельсию в одночасье. Слейте раствор антител.
Вымойте горки раствором MABT четыре раза, 25 минут на стирку с нежным возбуждением. Слейте MABT. Добавьте щелочный буфер фосфатазы в течение трех, пяти минут на инкубацию.
Удалите щелочный буфер фосфатазы. Добавьте решение для окрашивания BCIP-NBT. Держите горки в темноте.
Время окрашивания варьируется от нескольких минут до нескольких часов, даже в ночное время, что зависит от интенсивности сигнала. Состояние окрашивания следует чаще проверять в начале окрашивания. Например, с интервалом в несколько минут, и несколько часов не по крайней мере окрашивания.
Время проверки должно быть как можно меньше, чтобы избежать введения высокой фоновой сигнализации из-за воздействия света. Показаны репрезентативные сигналы гибридизации на месте. На месте гибридизации Sipunculus nudus coelomic жидкости с анти-чувство рибопроб, что цели dmrt1 указывает фиолетовый окрашивания сосредоточены в трофибластных клеток сперматозоидов, рисунок 2A и B.Sense riboprobe для dmrt1 не обнаружили каких-либо гибридизации сигнала, цифра 2C.
После просмотра этого видео, вы бы очень хорошее понимание того, как визуализировать выражения моделей целевой мРНК или IncRNA в целомической жидкости Sipunculus nudus.
