この技術の最も重要な利点は、可逆性、動物および維持のコストの削減、および短い妊娠期間である。また、動物の死亡率は、子宮摘出術の必要がないために減少する。そして、遺伝的なワークアップのためのより広い機会があります。
この技術は、先天性横隔膜ヘルニアの病態生理を調べたりすることができる。また、牛や肺の低形成症など、肺の他の疾患を理解するために適用することができます。まず、マウスを同じケージの中で午後 6 時から翌日の午前 9 時まで交尾できるようにします。
E0を決定するには、膣壁に均質な外帯が付いている膣プラグと繊維状の内側のゾーンを観察し、プラグ材料の繊維と混合した塊を形成するいくつかの精子を含む。交配時およびE10上のマウスの体重を記録して、継続的な妊娠を確実にし、E16.5で手術を行います。手術中に使用する器具を殺菌します。
手術プラットフォームを摂氏24度に予熱し、手術前に温かい生理学を準備します。回復のための暖かい環境を作成し、早期給餌のためにケージの中に湿った食べ物を残します。アルコールとポビドネヨウ素で腹部の表面をきれいにし、操作を通して無菌状態を維持します。
妊娠ダムの開腹術のために垂直切開を行い、すべての層を別々に切断します。両側の子宮の角を特定し、手術の候補胎児を決定する。両側に偶数の胎児がいる場合は、各子宮ホーンの2つの胎児を操作します。
そして、奇数がある場合、各子宮ホーンの1つの胎児に。視覚化に 2 倍のメガネを使用して、子宮ホーンを横方向に配置します。目と尾をガイドとして使用して、2本の指の間を上向きに見る子犬を配置します。
頭の延長と首の視覚化を可能にするために、子犬の頭に穏やかな圧力を適用します。外傷性針と6 by 0ポリプロピレン縫合糸を使用して気管閉塞またはTOを行う。胎盤を針の入口と出口から遠く離れて横に置いてください。
頸部の3分の1前部を通って胎盤から離れて、子宮の側面を横方向に針を挿入する。その後、針を首の正中線にそっと動かします。前部に向ける。
その後、気管の間の首を出て、頸動脈鞘と子宮の反対側に出ます。縫合糸を結び、膜と子宮壁の完全性を維持するように注意してください。腹部の子宮ホーンを交換し、閉鎖前に腹腔に温かい滅菌生理食塩水の2ミリリットルを注入します。
ランニング5を0で置き、腹壁を閉じる。そして、非実行中のシルク縫合糸で皮膚を閉じます。鎮痛のために腹腔内にブプレノルフィン1キログラムあたり0.1マイクログラムを適用し、ダムが暖かいインキュベーターで回復できるようにします。
操作された動物が自分自身を養い、個々のケージに一人で保管できることを観察してください。E18.5ですべての胎児をceasareanセクションで収穫し、その動きを見て生存率を確認する。すべての胎児の重量を量る。
胸郭の垂直切開を行い、肺を解剖する胸部切開術を行う。そして、体重に対する総肺を計算するためにそれらを量る。液体窒素、最適な切断温度化合物、およびドライアイスで組織を凍結スナップします。
クライオスタットを使用して10マイクロメートルのセクションでサンプルをカットし、ポリリジンコーティングスライドに取り付けます。スライドを摂氏60度で一晩焼き、ヘマトキシリンとエオシンで焼いたスライドを汚します。広視野顕微鏡を用いた10~20倍倍のスライドの画像。
タンパク質およびDNA分析の場合、スナップは組織を凍結し、300マイクロリットルの放射性免疫沈降アッセイバッファーで均質化します。18,000 x g、摂氏4度で5分間遠心分離機。次に、タンパク質、DNA、RNAを抽出して定量化します。
平均体重、肺体重、およびLBWRは、対照群よりもTO群において高かった。肺DNA量およびDNA対タンパク質比は、TO群においてより高かった。肺RNAでは差は認められず、対照群よりもTO群ではタンパク量が低かった。
E18.5対照肺の組織学的分析は、上皮表面間の空域および肥厚した間質を発達させる肺発達の後期または初期の嚢状段階を示した。TO群の肺は、主観的に多くの核を持つ中央および遠位空域を拡張していた。このプロトコルを試みるとき、我々は、針が調整された構造を破壊しないように、胎児の目が見えるように、首を伸ばして縫合を固定します。
CDHのニトリルファンおよびノックアウトモデルにおける胎児の再生に対する構造の除去は、この技術の将来の応用となるだろう。
