I vantaggi più importanti di questa tecnica sono la reversibilità, la riduzione del costo degli animali e il mantenimento e un periodo di gravidanza più breve. Inoltre, la mortalità animale è ridotta perché non c'è bisogno di isterectomia. E ci sono più ampie opportunità di lavoro genetico.
Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la fisiopatologia dell'ernia diaframmatica congenita. Può anche essere applicato alla comprensione di altre malattie nel polmone, come mucche e ipoplasia polmonare. Inizia permettendo ai topi di accoppiarsi nella stessa gabbia dalle 18:00 alle 9:00 del giorno successivo.
Per determinare E0, osservare la spina vaginale che ha una zona esterna omogenea attaccata alla parete vaginale e una zona interna fibrosa e includere alcuni spermatozoi che formano masse impigliate mescolate con le fibre del materiale della spina. Registrare il peso dei topi al momento dell'accoppiamento e sull'E10 per garantire una gravidanza in corso ed eseguire l'intervento chirurgico a E16.5. Sterilizzare gli strumenti che verranno utilizzati durante l'intervento chirurgico.
Preriscaldare la piattaforma chirurgica a 24 gradi Celsius e preparare la salina calda prima dell'intervento chirurgico. Crea un ambiente caldo per il recupero e lascia il cibo umido all'interno della gabbia per l'alimentazione precoce. Pulire la superficie addominale con alcol e iodio povidone e mantenere condizioni sterili durante l'operazione.
Eseguire un'incisione verticale per la laparotomia delle dighe gravide e tagliare tutti gli strati separatamente. Identificare le corna uterine su ciascun lato e determinare i feti candidati per l'intervento chirurgico. Operare su due feti in ogni corno uterino se c'è un numero pari di feti su ciascun lato.
E su un feto in ogni corno uterino se c'è un numero dispari. Utilizzando occhiali di ingrandimento 2X per la visualizzazione, posizionare il corno uterino in modo trasversale. Posizionare i cuccioli rivolti verso l'alto tra due dita usando gli occhi e la coda come guida.
Applicare una leggera pressione sulla testa del cucciolo per consentire l'estensione della testa e la visualizzazione del collo. Eseguire l'occlusione tracheale o TO utilizzando un ago atraumatico e una sutura in polipropilene 6 per 0. Tenere la placenta sul lato e lontano dai punti di ingresso e di uscita dell'ago.
Inserire l'ago trasversalmente attraverso il lato dell'utero, lontano dalla placenta attraverso la parte anteriore di un terzo del collo. Quindi spostare delicatamente l'ago sulla linea mediana del collo. Dirigerlo verso la parte anteriore.
Quindi uscire dal collo tra la trachea e di fronte alla focaia carotide e all'utero. Annodare la sutura, facendo attenzione a mantenere l'integrità delle membrane e della parete uterina. Sostituire il corno uterino nell'addome e iniettare due millilitri di soluzione salina sterile calda nella cavità peritoneale prima della chiusura.
Posizionare una sutura di poliglactina 5 per 0 per chiudere la parete addominale. E chiudi la pelle con una sutura di seta non funzionante. Applicare 0,1 microgrammi per chilogrammo di buprenorfina intraperitonealmente per l'analgesia e lasciare che la diga si riprenda in un'incubatrice calda.
Osserva che l'animale operato può nutrirsi da solo e tenerlo solo nella sua gabbia individuale. Raccogli tutti i feti entro l'E18.5 per sezione ceasarea e controlla la loro vitalità osservando i loro movimenti. Pesa tutti i feti.
Eseguire un'incisione verticale sul torace per una toracotomia per sezionare i polmoni. E pesarli per calcolare il rapporto totale tra polmone e peso corporeo. Snap congela il tessuto in azoto liquido, composto ottimale della temperatura di taglio e ghiaccio secco.
Tagliare i campioni in sezioni di 10 micrometri utilizzando un criostato e montarli su scivoli rivestiti in polilisina. Cuocere gli scivoli durante la notte a 60 gradi Celsius e macchiare gli scivoli al forno con ematossilina ed eosina. Immagine delle diapositive con ingrandimento da 10 a 20X, utilizzando un microscopio widefield.
Per le analisi delle proteine e del DNA, agganciare il tessuto e omogeneizzarlo in 300 microlitri di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione. Centrifuga a 18.000 x g e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi estrarre e quantificare proteine, DNA e RNA.
Il peso corporeo medio, il peso polmonare e l'LBWR erano più alti nel gruppo TO che nel gruppo di controllo. Le quantità di DNA polmonare e il rapporto DNA/proteina erano più alti nel gruppo TO. Non è stata osservata alcuna differenza nell'RNA polmonare e le quantità di proteine erano inferiori nel gruppo TO rispetto al gruppo di controllo.
Le analisi istologiche dei polmoni di controllo E18.5 hanno mostrato lo stadio sacculare tardivo o precoce dello sviluppo polmonare con lo sviluppo di spazi aerei e l'interstizio ispessito tra le superfici epiteliali. I polmoni del gruppo TO avevano spazi aerei centrali e distali dilatati con un numero soggettivamente più elevato di nuclei. Quando si tenta questo protocollo, fissiamo le suture in modo che gli occhi del feto siano visibili e il collo sia esteso in modo che l'ago non interrompa le strutture regolate.
La rimozione delle strutture alla rinascita del feto nel ventilatore nitrile e nei modelli knockout di CDH saranno le future applicazioni di questa tecnica.
