Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind Reversibilität, Senkung der Kosten der Tiere und Wartung, und eine kürzere Schwangerschaftszeit. Darüber hinaus wird die Tiersterblichkeit reduziert, weil keine Hysterektomie erforderlich ist. Und es gibt breitere Möglichkeiten für genetische Aufarbeitung.
Diese Technik kann zur Untersuchung der Pathophysiologie der angeborenen Zwerchfellhernie verwendet werden. Es kann auch angewendet werden, um andere Krankheiten in der Lunge zu verstehen, wie Kühe und Lungenhypoplasie. Beginnen Sie damit, dass sich die Mäuse von 18:00 Uhr bis 21:00 Uhr am nächsten Tag im selben Käfig paaren können.
Um E0 zu bestimmen, beobachten Sie den Vaginalstecker, der eine homogene, äußere Zone an der Scheidenwand und eine innere Zone, die faserig ist, hat und einige Spermatozoen enthält, die verschränkte Massen bilden, die mit den Fasern des Steckermaterials vermischt sind. Zeichnen Sie das Gewicht der Mäuse zum Zeitpunkt der Paarung und auf E10 auf, um eine laufende Schwangerschaft zu gewährleisten und führen Sie die Operation bei E16.5 durch. Sterilisieren Sie die Instrumente, die während der Operation verwendet werden.
Die Operationsplattform auf 24 Grad Celsius vorheizen und vor der Operation warme Saline vorbereiten. Schaffen Sie eine warme Umgebung für die Erholung und lassen Sie nasse Nahrung im Käfig für die frühe Fütterung. Reinigen Sie die Bauchoberfläche mit Alkohol und Povidon Jod und halten Sie während der gesamten Operation sterile Bedingungen.
Führen Sie einen vertikalen Schnitt für die Laparotomie von trächtigen Muttertieren durch und schneiden Sie alle Schichten getrennt. Identifizieren Sie die Uterushörner auf jeder Seite und bestimmen Sie die Kandidaten Föten für die Operation. Betreiben Sie an zwei Föten in jedem Gebärmutterhorn, wenn es eine gerade Anzahl von Föten auf jeder Seite.
Und auf einem Fötus in jedem Gebärmutterhorn, wenn es eine ungerade Zahl gibt. Positionieren Sie das Gebärmutterhorn mit 2X Vergrößerungsgläsern zur Visualisierung quer. Positionieren Sie die Welpen nach oben zwischen zwei Fingern mit den Augen und dem Schwanz als Leitfaden.
Tragen Sie sanften Druck auf den Kopf des Welpen, um eine Verlängerung des Kopfes und eine Visualisierung des Halses zu ermöglichen. Führen Sie Trachealverschluss oder TO mit einer atraumatischen Nadel und einer 6 mal 0 Polypropylen-Nähte durch. Halten Sie die Plazenta auf der Seite und weit von den Ein- und Ausstiegspunkten der Nadel.
Legen Sie die Nadel quer durch die Seite der Gebärmutter, weg von der Plazenta durch den ein Drittel vorderen Teil des Halses. Dann bewegen Sie die Nadel sanft an die Mittellinie des Halses. Richten Sie es auf den vorderen Teil.
Dann verlassen Sie den Hals zwischen der Luftröhre und gegenüber der Karotisscheide und Gebärmutter. Knoten Sie die Naht, unter Behutsam, um die Integrität der Membranen und Gebärmutterwand zu erhalten. Ersetzen Sie das Gebärmutterhorn im Bauch und injizieren Sie zwei Milliliter warme sterile Saline in die Peritonealhöhle vor dem Verschluss.
Legen Sie eine laufende 5 von 0 Polyglactin Naht, um die Bauchwand zu schließen. Und schließen Sie die Haut mit einer nicht laufenden Seidennaht. 0,1 Mikrogramm pro Kilogramm Buprenorphin intraperitoneal für Analgesie auftragen und den Damm in einem warmen Inkubator erholen lassen.
Beachten Sie, dass sich das operierte Tier selbst ernähren und in seinem individuellen Käfig allein halten kann. Ernten Sie alle Föten von E18.5 durch Ceasarean Abschnitt und überprüfen Sie ihre Lebensfähigkeit, indem Sie ihre Bewegungen beobachten. Wiegen Sie alle Föten.
Führen Sie einen vertikalen Schnitt am Thorax für eine Thorakotomie, um die Lunge zu sezieren. Und wiegen Sie sie, um das Gesamtgewicht von Lunge zu Körper zu berechnen. Fangen Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff, optimale Schnitttemperatur Verbindung und Trockeneis einfrieren.
Schneiden Sie die Proben in Abschnitten von 10 Mikrometern mit einem Kryostat und montieren Sie sie auf polylysinbeschichteten Dias. Backen Sie die Rutschen über Nacht bei 60 Grad Celsius und färben Sie die gebackenen Dias mit Hämatoxylin und Eosin. Bild der Dias mit 10- bis 20-facher Vergrößerung mit einem Weitfeldmikroskop.
Für Protein- und DNA-Analysen frieren Sie das Gewebe ein und homogenisieren es in 300 Mikrolitern Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer. Zentrifuge bei 18.000 x g und 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Dann extrahieren und quantifizieren Sie Protein, DNA und RNA.
Das mittlere Körpergewicht, das Lungengewicht und LBWR waren in der TO-Gruppe höher als in der Kontrollgruppe. Lungen-DNA-Mengen und das DNA-Protein-Verhältnis waren in der TO-Gruppe höher. In der Lungen-RNA wurde kein Unterschied beobachtet, und die Proteinmengen waren in der TO-Gruppe geringer als in der Kontrollgruppe.
Histologische Analysen der E18.5-Kontrolllunge zeigten das späte oder frühe sakkare Stadium der Lungenentwicklung mit sich entwickelnden Lufträumen und verdickten Interstitiums zwischen epitheliaalen Oberflächen. Die Lunge in der TO-Gruppe hatte zentrale und distale Lufträume mit subjektiv höheren Kernzahlen erweitert. Beim Versuch dieses Protokolls, Wir fixieren die Nähte in einer Weise, dass die Augen des Fötus sichtbar sind und der Hals verlängert wird, so dass die Nadel nicht die eingestellten Strukturen stören.
Die Entfernung der Strukturen zur Wiedergeburt des Fötus im Nitril-Fan und Knockout-Modelle der CDH wird die zukünftige Anwendung dieser Technik sein.
