As vantagens mais importantes dessa técnica são a reversibilidade, a redução do custo dos animais e a manutenção e um período de gravidez mais curto. Além disso, a mortalidade animal é reduzida porque não há necessidade de histerectomia. E há oportunidades mais amplas para o trabalho genético.
Esta técnica pode ser usada para investigar a fisiopatologia da hérnia diafragmática congênita. Também pode ser aplicado à compreensão de outras doenças no pulmão, como vacas e hipoplasia pulmonar. Comece permitindo que os ratos acasalem na mesma gaiola das 18:00 às 9:00 do dia seguinte.
Para determinar o E0, observe o plugue vaginal que tem uma zona externa homogênea presa à parede vaginal e uma zona interna que é fibrosa e inclua alguns espermatozoides que formam massas emaranhadas misturadas com as fibras do material plugue. Registo o peso dos camundongos no momento do acasalamento e no E10 para garantir a gravidez contínua e realizar a cirurgia em E16,5. Esterilize os instrumentos que serão usados durante a cirurgia.
Pré-aqueça a plataforma de cirurgia a 24 graus Celsius e prepare soro fisiológico quente antes da cirurgia. Crie um ambiente quente para recuperação e deixe comida molhada dentro da gaiola para a alimentação precoce. Limpe a superfície abdominal com álcool e iodo povidone e mantenha condições estéreis durante toda a operação.
Realize uma incisão vertical para a laparotomia de barragens grávidas e corte todas as camadas separadamente. Identifique os chifres uterinos de cada lado e determine os fetos candidatos para a cirurgia. Opere dois fetos em cada chifre uterino se houver um número uniforme de fetos de cada lado.
E em um feto em cada chifre uterino se houver um número ímpar. Usando óculos de ampliação 2X para visualização, posicione o chifre uterino de forma transversal. Posicione os filhotes voltados para cima entre dois dedos usando os olhos e a cauda como guia.
Aplique pressão suave na cabeça do filhote para permitir a extensão da cabeça e a visualização do pescoço. Realize a oclusão traqueal ou TO usando uma agulha atraumática e uma sutura de polipropileno 6 por 0. Mantenha a placenta ao lado e longe dos pontos de entrada e saída da agulha.
Insira a agulha transversalmente através do lado do útero, longe da placenta através da parte anterior de um terço do pescoço. Em seguida, mova a agulha suavemente para a linha média do pescoço. Direcione-o para a parte anterior.
Em seguida, saia do pescoço entre a traqueia e em frente à baia carótida e útero. Nó a sutura, tomando cuidado para manter a integridade das membranas e parede uterina. Substitua o chifre uterino no abdômen e injete dois mililitros de soro fisiológico quente na cavidade peritoneal antes do fechamento.
Coloque uma sutura de poliglactina de 5 por 0 para fechar a parede abdominal. E feche a pele com uma sutura de seda não-corrida. Aplique 0,1 micrograma por quilograma de buprenorfina intraperitonealmente para analgesia e permita que a barragem se recupere em uma incubadora quente.
Observe que o animal operado pode se alimentar e mantê-lo sozinho em sua gaiola individual. Colher todos os fetos por E18.5 por seção ceasareana e verificar sua viabilidade observando seus movimentos. Pesar todos os fetos.
Realize uma incisão vertical no tórax para uma toráctica para dissecar os pulmões. E pesá-los para calcular a relação peso total entre pulmão e corpo. Es clique para congelar o tecido em nitrogênio líquido, composto de temperatura de corte ideal e gelo seco.
Corte as amostras em seções de 10 micrômetros usando um criostat e monte-as em lâminas revestidas de polilise. Asse os slides durante a noite a 60 graus Celsius e manche os slides assados com hematoxilina e eosina. Imagem dos slides em ampliação de 10 a 20X, usando um microscópio widefield.
Para análises de proteínas e DNA, congele o tecido e homogeneize-o em 300 microliters de tampão de ensaio radioimunoprecipitação. Centrifugar a 18.000 x g e 4 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, extrair e quantificar proteína, DNA e RNA.
O peso médio do corpo, o peso pulmonar e o LBWR foram maiores no grupo TO do que no grupo controle. As quantidades de DNA pulmonar e a relação DNA/proteína foram maiores no grupo TO. Não foi observada diferença no RNA pulmonar, e as quantidades de proteínas foram menores no grupo TO do que no grupo controle.
Análises histológicas dos pulmões de controle E18.5 mostraram o estágio saccular tardio ou precoce do desenvolvimento pulmonar com espaços aéreos em desenvolvimento e interstício espessado entre superfícies epiteliais. Os pulmões do grupo TO tinham espaços aéreos centrais e distais dilatados com números subjetivamente maiores de núcleos. Ao tentar este protocolo, fixamos as suturas de uma forma que os olhos do feto são visíveis e o pescoço é estendido para que a agulha não interrompa as estruturas ajustadas.
A remoção das estruturas para o renascimento do feto no ventilador de nitrilho e modelos de nocaute do CDH serão as futuras aplicações desta técnica.
