このプロトコルは、テロメア上のタンパク質凝縮物を誘導する化学二量体化システムについて説明する。他のゲノム座に凝縮物を誘導するように容易に適合することができ、クロマチン関連凝縮物の形成および機能を調査するのに適している。この方法は、生細胞イメージングに必要な時間分解能を提供し、生化学的アッセイのための細胞集団における相分離を維持する。
まず、DMSOの2量体を10ミリモルで溶解し、プラスチック製のマイクロ遠心分離チューブにマイナス80°Cで保存して長期保存します。イメージング培地中の10ミリモル二量体剤のアリコートを10マイクロモルのストック濃度に希釈し、マイナス20度で保存します。使用する準備ができたら、成長培地またはイメージング培地中で100ナノモルの最終的な作業濃度に二量化剤を希釈する。
第10~5番目の細胞を直径12ミリメートルの円形カバーグラスに、ポリD-リジンを6ウェルプレートにコーティングした。次に、Halo-GFP-TRF1とmCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDFR-SIM変異体プラスミドで細胞をトランスフェクトし、免疫蛍光に進む前に24〜48時間待ちます。希釈した100ナノモル二量体を細胞に加え、摂氏37度で4~5時間インキュベートします。
インキュベーション後、4%ホルムアルデヒドと0.1%トリトンX-100を含むPBS溶液中の細胞を室温で10分間固定し、細胞を透過させます。その後、細胞をPBSで3回洗浄します。ウォッシュカバーは、TBS-Txの50マイクロリットルで2回、抗体希釈バッファーの50マイクロリットルで1回スリップします。
一次抗PML、抗SUMO-1、または抗SUMO-2および3抗体を一晩加湿したチャンバーで摂氏4度で50マイクロリットルずつインキュベートします。ウォッシュカバーは、抗体希釈バッファーで3回スリップして結合していない一次抗体を除去し、室温の暗い箱の中で細胞を1時間インキュベートします。染色後、洗濯カバーはTBS-Txで3回スリップします。
1 ミリリットル DAPI あたり 1 マイクログラムの 2 マイクロリットルを追加してスライドにラベルを付け、カバースリップを裏返し、DAPI ドロップに配置します。カバースリップの端から余分な液体を吸引する。スライドをマニキュアで密封し、乾燥させ、カバースリップの上部を水ですすきます。
スライドをイメージングするまで冷凍庫に入れる。6ウェルプレートにポリD-リジンでコーティングされた12ミリメートル円形カバーグラスの第5細胞にシード10を、ハロ-TRF1およびmCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDHFR-SIM変異体プラスミドでトランスフェクトする。4%ホルムアルデヒドを室温で10分間固定し、PBSで4回洗浄します。
IF-FISHの場合は、一次および二次抗体で細胞を染色し、室温で10分間4%ホルムアルデヒドで再固定し、PBSで4回洗浄し、エタノールシリーズでカバースリップを脱水します。488テロメアC-PNAプローブを5マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液で5分間摂氏75度でカバースリップをインキュベートし、室温で加湿したチャンバーで一晩カバースリップをインキュベートします。カバースリップを洗浄バッファーで1回2分間洗浄して室温で洗浄し、イメージング用の取り付け媒体に1ミリリットルDAPIあたり1マイクログラムで取り付けます。
ライブイメージングの場合、カバースリップを環境室の加熱された段階の磁気チャンバーに取り付け、フェノールレッドなしで1ミリリットルのイメージング媒体で細胞を維持します。原稿の説明に従って顕微鏡と環境制御装置を設置する。テロメアに明るいGFP信号を持つ細胞を見つけ、サイトソルの拡散性mCherry信号を検出します。
約20個の細胞を見つけ、XYZ情報で各位置を記憶し、タイムラプスイメージングのパラメータを設定します。Z では合計 8 マイクロメートル、GFP チャネルと mCherry チャネルの両方で 2 ~ 4 時間の間隔は 5 マイクロメートルで 0.5 マイクロメートル間隔を使用します。594ナノメートルの30%、488ナノメートルの電力強度の50%を使用し、露出時間は200ミリ秒、カメラゲインは300です。
イメージングを開始し、1回のループを事前二量化として使用します。次に、撮像を一時停止し、10マイクロモル二量体装置の15マイクロリットルを含むイメージング媒体を0.5ミリリットルのイメージングチャンバに加え、ステージに触れないように注意し、イメージングを再開する。二量体化を逆にする準備ができたら、イメージングを一時停止し、イメージングチャンバーに100ミリモルストックTMPの2マイクロリットルを含むイメージング培地の0.5ミリリットルを追加します。
細胞のイメージングを1~2時間継続します。固定イメージングの場合は、ライブイメージングと同じ顕微鏡設定を使用しますが、ステージ加熱は行わない。トランスフェクトされた細胞を選択する赤信号で約30〜50個の細胞を見つけます。
Z.Z.で合計8マイクロメートルの0.3マイクロメートル間隔の画像を取得する 647 ナノメートルの 80%、561 ナノメートルの 80%、488 ナノメートルの 70% の電力強度を使用し、露出時間は 600 ミリ秒、カメラゲインは 300 です。SUMOのテロメラ局在化は、テロメアDNA FISHおよびSUMOタンパク質免疫蛍光を用いて同定した。SIMリクルートメントを有する細胞は、SIM変異体リクルートメントを有する細胞と比較してSUMO-1およびSUMO-2および3を富化し、SIM二量体がテロメアに対するSUMO濃縮を誘導することを示すSUMO-SIM相互作用に依存する。
二量体化後のTRF-1とSIMのタイムラプスムービーをここに示します。SIMはテロメアの採用に成功し、液滴の形成と成長が予測されるように、SIMとTRF-1病巣の両方がより大きく明るくなりました。また、TRF-1病巣の融合が観察され、テロメア数の減少や経時のテロメア強度の上昇に示されるように、テロメアクラスタリングが見られた。
これに対し、SIM変異体は二量体化後にテロメアに採用されたが、液滴形成やテロメアクラスタリングを誘導せず、相分離およびテロメアクラスタリングがSUMO-SIM相互作用によって駆動されることを示している。過剰な遊離TMPを添加した後に相分離およびテロメアクラスタリングの逆転が観察された。テロメア数が増加し、テロメア強度が時間の経過とともに減少した。
テロメアDNA FISHおよびPMLタンパク質IFによって同定されたアプブの代表的な画像を以下に示す。SIMを募集した細胞は、SIM変異体をリクルートした細胞よりも多くのアプブを有し、二量体化誘導凝縮物が実際にADBであることを示唆している。このプロトコルを実行する場合は、光に敏感な二量体を光に当てないでください。
インキュベーション中に赤い光を発し、アルミ箔でセルをラップするランプを備えた暗い部屋で作業してください。この手順に従って、近接標識を使用して、誘導凝縮物中の成分の包括的なリストを生成することができます。ライブイメージングは、凝縮物中の成分のダイナミクスに従うために使用することができます。
これらのメソッドは、コンデンセート組成制御を管理する役割を決定するのに役立ちます。
