ターナー症候群(45XO)の胎児細胞による、その症候群に伴う神経障害の下流モデリングのための人工多能性幹細胞の生成

ターナー症候群は、完全にまたは部分的に欠けているX染色体に関連する稀な状態である。この症候群は、不妊症、低身長、心血管障害、および神経認知障害を特徴とする。場合によっては、胎児の死を引き起こす。

無数胎児の体細胞は生物学的に価値があるが、それらは短命であり、研究における使用を制限する。iPSCの生成は、したがって、無数形質の永久保存のための細胞調製の有効な方法である。彼らは自己更新であり、初期の胚発生を連想させる特殊な細胞型に分化することができる。

核小説を通じた非統合エピソームリプログラミングプラスミドの提供は、完全に再プログラムされた安定したiPSCを生成するための効率的で再現可能な方法です。この方法は、プログラミングが困難なセルにも使用できます。このプロトコルでは、胎児物質からのiPSCのアネプリオドによる再生について説明する。

収集した胎児絨毛絨毛を滅菌ペトリ皿に移します。1X抗生物質抗ミキサン溶液を含むPBSで数回洗浄してください。ピペット処理でPBSを完全に取り除く。

ビリにコラゲターゼブレンド1mlを加え、摂氏37度で10分間、または組織が崩壊するまでインキュベートします。インキュベーション後、10%の牛血清を含む培地を添加してコラゲターゼを中和する。ペトリ皿の内容物を15mlのチューブに移します。

崩壊した絨毛と放出細胞を収集するために消化を遠心分離する。上清を慎重にデカントします。プレートは、T25培養フラスコおよびAmnioMAX培地中で放出された細胞と共に絨毛を崩壊させ、コンフルエント線維芽細胞培養が得られるまで増殖する。

繊維芽細胞と培養を展開し、その後のトランスフェクションおよび特性評価実験で使用するための在庫を準備します。リプログラミングプラスミドを含むアルカリの培養物を準備する。メーカーの指示に従って、ミディプラスミド精製キットを使用してプラスミドを分離します。

各パレットを適切な量のDNAse RNAseフリー水で再中断し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度を得る。メーカーの指示に従って、ECoR1制限消化キットを使用してプラスミドを確認します。絨毛性絨毛線維芽細胞をトリプシン化する。

中和し、遠心分離機を使用して細胞を採取する。上清をデカントし、細胞を5mlOPTI-MEMで再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、核の100万個の細胞を除去します。

遠心分離機は、セルパレットを取得します。アマキシNHDFニュークレオフアクターキットを使用して核切除を行います。キットに用意されている0.5 mLサプリメントと2.25 mL核級の核を混合して、中性硬化剤試薬を調製します。

100マイクロリットルの核を除去し、各プラスミドを1マイクログラムずつ加えます。このミックスで100万個の細胞を穏やかに再懸濁する。細胞DNA懸濁液をキュベットに移し、サンプルが気泡を使わずにキュベットの底部を覆っていることを確認します。

キュベットをキャップし、ホルダーに挿入します。高効率のために核のアクタープログラムD-23を選択し、適用します。ホルダーからキュベットを取り出し、1 mLのAmnioMAXメディアを追加します。

キットに用意されているピペットを使用して、ペトリ皿を処理した組織培養物に内容物をそっと移します。加湿した二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートします。AmnioMAX培地中の細胞を10日間維持し、20日間多能性培地に移行する。

iPSC拡張の場合、プルドガラスピペットを使用して、リプログラミング皿で形成された胚性幹細胞様コロニーを手動で解剖する。iPSCを適切に伝播し、5~7日ごとにマッサージを行います。iPCSは、多能性マーカーアルカリホスファターゼに陽性であった。

iPSCコロニーを小片に切断し、胚性体培地中の低い付着ペトリ皿でめっきすることによって胚体を生成する。外胚分化は、外胚分化培地中の4日目の胚体をめっきすることによって誘導される。同様に、中胚分化は、メソダーム分化培地において8日目の胚体をめっきすることによって誘導される。

内胚葉分化を誘導するために、培養iPSCを単層中の内胚分化培地中に含む。線維芽細胞の形態学的変化を、再プログラミングの過程でモニタリングした。それらは上皮細胞様形態を発現し、コンパクトなコロニーを形成した。

また、細胞は細胞質比に対する高さの核を有し、培養において多能性細胞の典型的なものである。iPSCは45のXOキャリア型を有し、多能性マーカーOCT4、NANOG、SOX 2、SSEA 4、TRA-1-81およびE-CADHERINに陽性であった。細胞を代表的な胚芽層マーカーに染色した。

ターナー症候群は、このように神経認知の欠陥を開発します.ターナー症候群iPSCに由来するニューロンは、優れたモデルであることができます。これは、正常な解離性ターナー症候群の新しいラインを理解するためにシャートリプレートでモデル化されています。