この手順の全体的な目的は、マウス骨髄内に位置する巨核球の超構造を観察し、高解像度の透過電子顕微鏡を用いて異なる成熟段階を定量化することです。主な利点は、我々が知っているように成熟の完全なレベルに達していない体外培養巨核球とは異なるネイティブ環境で巨核球の直接検査です。標準的なプロトコルに従って12〜18週齢のC57BL/6マウスから脛骨および大腿骨を収穫した後、鋭いカミソリの刃を使用して各骨から骨端を除去する。
ピンセットで各骨を保持し、カコジレートバッファーで満たされた5ミリリットルの注射器に取り付けられた21ゲージ針を骨の一端に挿入し、骨髄を2ミリリットルの新鮮なカコジレートバッファーを含む15ミリリットルのコレクションチューブに洗い流します。洗い流した直後に、プラスチックピペットを使用して骨髄シリンダーを1ミリリットルの新鮮なグルタルアルデヒド固定液に移し、室温で60分間インキュベーションします。アガロースに骨髄を埋め込む場合は、固定サンプルを新鮮なカコダイレートバッファーで洗浄し、プラスチックピペットを使用して慎重に骨髄をガラススライドに移します。
暖かいピペットを使用して、骨髄シリンダーに2%液体寒天の低下を素早く適用し、すぐに1〜2分間氷の上にスライドを置きます。寒天が固まったら、ステレオ顕微鏡と鋭いカミソリの刃を使用して各骨髄シリンダーの四肢を捨て、トリミングされた骨髄ブロックを1ミリリットルのカコジレートバッファーを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。樹脂埋め込みの場合は、カコジレートバッファーで1%オスミウム四酸化物質を化学フードに1時間、4°Cで1時間固定してから、カコダイレートバッファーで1回、蒸留水で1回洗浄します。
水洗い後、4%の酢酸を蒸留水で1時間染色し、続いて蒸留水で2回洗浄します。最後の洗浄後、示されているように、エタノール浸漬と蒸留水の上昇シリーズを通してブロックを脱水します。骨髄の中のエポキシ樹脂の均一な浸潤と重合を得るために、プロピレンオキシドの2つの連続した浴でブロックを15分間インキュベートしてから、室温でゆっくりとした回転式シェーカーで100%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の1対1の混合物でサンプルをインキュベートします。
インキュベーションの終わりに、同じ条件下で一晩インキュベーションのために骨髄ブロックに100%エポキシ樹脂を加え、2時間の別のインキュベーションのために100%エポキシ樹脂を加える。インキュベーションの最後に、顕微鏡を使用して平らなシリコーン型の骨髄ブロックを向け、その後の横断断断面を可能にし、金型をエポキシ樹脂で満たし、48時間摂氏60度にします。超薄型断面の場合は、サンプルブロックを超ミクロトームサポートに取り付け、サポートをサンプルホルダーに取り付けます。
ダイヤモンドフライスカッターを使用してサンプルを45度の角度でトリミングし、水タンクを装備したダイヤモンドナイフブレードを使用して横断500と100ナノメートルの厚いセクションをそれぞれ切断し、ループを使用して水面に浮かぶ500ナノメートルのセクションをガラススライドに移し、100ナノメートル厚いナノメートルを堆積させます200メッシュの薄いバーの銅格子に、下に紙のフィルターを持つセクション。トルイジンブルー染色の場合、60度のホットプレートに500ナノメートルの厚いセクションを描いた後、蒸留水に1%トルイジンブルーを1〜2分間のインキュベーション用に加えます。インキュベーションの終わりに、蒸留水でサンプルを洗浄します。
スライドが乾燥したら、取り付け媒体を使用してカバースリップでサンプルを取り付け、光顕微鏡でサンプルを見ます。コントラスト染色の場合は、100ナノメートルの切片に4%ウラニル酢酸を5分間ラベルし、その後蒸留水で5分間の3回の水を流します。最後の洗浄の後、リードクエン酸で3分間部分を汚し、続いて示すように蒸留水に5分間洗浄します。
最後の洗浄の後、各グリッドの下側をフィルターペーパーの部分に接触させて、グリッドをフィルター用紙に置いて乾燥させます。TEMによってセクションを調べるには、グリッドが乾燥したら、低倍率を選択して製剤の一般的な品質を評価します。各横断部の成熟の各段階から巨核球の数を決定するには、より高い倍率を選択し、完全に組織で覆われている正方形のステージI、II、またはIII巨核球の数を定量化します。
本代表組織学的解析では、巨大核球の小型血管の連続性と大きさおよび形状が明確に観察される。マウス巨核球は、成熟の4つの段階に分かれています。ステージI巨核球は大きな核を持っています。
境界膜系の最も初期の検出可能な段階の存在もこの段階の重要な基準である。ステージIIでは、顆粒形成が始まり、境界膜系の発達が開始される。ステージIII巨核球は、よく発達した境界膜系、細胞質領域と卵性子を欠いた末梢領域、および偏心的に位置する核を有する巨大な細胞である。
巨核球成熟のピレノサイトステージは、裸の核によって特徴付けられる。図示するように、巨核球は内皮細胞と接触して頻繁に観察される。時には、巨核球は、内皮に浸透する短い侵襲的な突起を形成するか、または彼らは、鼻腔内にプロ血小板を拡張する。
TEMはまた、超構造的な詳細の視覚化だけでなく、巨核球に巻き込まれた造血細胞の存在を可能にする。骨髄の洗い流しは、骨解剖後、すぐに慎重に行われなければなりません。組織の完全性を最大化するために、骨髄は脱水前に寒天のゲルで囲まれている。
この手順に従って、骨髄ブロックは異なる倍率で画像化することも、焦点を当てたイオンビーム走査電子顕微鏡などの他の3D電子顕微鏡分析に使用することもできます。
