この手順の全体的な目的は、マウス巨核球からのプロ血小板の形成をリアルタイムで従い、そのネイティブ環境で成熟した。この方法は、シンプルで再現性が高く、高速であるという利点があります。多くの巨核球を分析し、わずか6時間でプロ血小板の形成を可視化することができ、インビトロのマウス巨核球のように培養の最初の日を待つのはいずに。
この方法の興味深い応用は、特にプロ血小板拡張のステップにおいて、医薬治療または遺伝子変異の効果を研究する可能性である。ここでは、インビトロ培養の場合のように、分化プロセスに干渉はありません。このビデオは、骨髄を洗い流し、切断するこれらの重要なステップを確保するのに役立ちます.
また、血友病の欠陥の特徴付けに本当に有用である形態と巨核球を分類する方法も説明されています。まず、37°Cでタイロードのバッファを温め、顕微鏡の暖房室をオンにして温度を摂氏37度にします。タイマー、インキュベーションチャンバー、5ミリリットル21ゲージシリンジ、鉗子、カミソリの刃、パスツールピペット、ガラススライド、15ミリリットル遠心チューブなどの必要なすべてのツールを準備します。
膝側の大腿骨の開口部に21ゲージの針を導入して、タイロードの緩衝液の2ミリリットルで骨髄を洗い流し、プランジャーをゆっくりと押して無傷の骨髄シリンダーを取り出します。3分リットルのプラスチックピペットを使用して、無傷の骨髄をガラススライドに慎重かつ穏やかに移します。フラッシュ時に圧縮された可能性のある骨髄の端部を切り取ります。
その後、巨大核球を損傷しないように鋭利なカミソリの刃を使用して0.5ミリメートルの厚さの薄い横切り部を切断します。プラスチック製のピペットを使用して、Tyrodeのバッファーを含む1ミリリットルチューブに10のセクションを収集します。慎重に13ミリメートルの直径とインキュベーションチャンバーにセクションを転送します。
バッファーを吸引し、5%マウス血清で補ったタイロードのバッファーの 30 マイクロリットルにボリュームを調整します。断面を距離に合わせ22 x 55ミリメートルのカバースリップで自己接着室を密封し、気泡の形成を避けるためにカバースリップを傾斜させます。
チャンバーを摂氏37度の暖房室に置きます。クロノメーターを開始し、37°Cで6時間実験を実行し、メガカルヨサイトの変換を記録するためにビデオを作ります。30分後、骨髄細胞は、モノ層を形成する外植の周囲に徐々に移動する。
1時間のインキュベーションの後、巨核球は大きな大きさおよびポリロブラ核によって識別することができる。3時間の培養後に巨核球の数が増加し、一部は長い拡張を有する。インキュベーションチャンバー内の各セクションをローカライズするマップを描画します。
1時間後、各セクションの周囲に巨大なポリロブラ細胞である可視の巨核球を特定し、その位置を図面にプロットします。3 時間と 6 時間後にこの手順を繰り返します。巨核球は、インキュベーションチャンバーの密封後3時間と6時間後に、その形態に従って手動で数え、分類される。
それらは小さく、厚い意図を持つ大きい、そしてプロメトレット拡張に分類される。マッピングの助けを借りて、その進化は時間の経過とともに続けることができます。結果は各観測時間における各クラスの割合で表されます。
古典的には、周囲に見える巨核球の半分は、野生型マウス骨髄の6時間でプロ血小板を拡張する。丸い巨核球の運命は、それらがプロ血トを形成する方法をイメージするために時間の経過とともに連続画像をキャプチャすることによって続いた。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、実験の間、外植を摂氏37度に保つことです。
温度が異なって結果が変わる可能性があります。興味深いことに、外植プロトコルは内向的な顕微鏡検査実験の後に使用することができます。結局、骨髄外植の巨核球は自然に蛍光を出し、その挙動を容易に調べることができます。
これにより、同じ動物に対して異なる治療を組み合わせ、マウスの数を減らすことが可能になります。結論として、外植法は速く、簡単で、外的なプロ血小板に天然巨核球の容量に関する多くの情報を提供する。結果として生じる質的および定量的な発見は、血栓性の病気の私達の理解の鍵である。
生理学的または病理学的文脈で。
