このプロトコルは、TGF-βファミリーメンバーを含む分離前駆体タンパク質のより広い範囲が、タンパク質分解切断後の活性タンパク質に変換されるプロセスを研究するために使用することができる。このプロトコルの主な利点は、可視化された条件下で生体内で高濃度のTGF-β切断産物を得るために非常に迅速かつ安価な方法を提供することである。まず、翌日に注射した後、Ficoll溶液と死んだ胚または死んでいる胚を取り除き、胚をMBSで1、2回洗い流し、室温またはインキュベーターのベンチでMBSの胚を培養して発達を遅くする。
熱し、希望の設定でマイクロピペットプーラーを使用して細かい点にガラスの毛細血管を引っ張ります。鉗子を使用して、引っ張られた針の先端を切り取ります。詰まりを防ぐために、ブラストセレ吸引針の開口部はマイクロインジェクション針よりも大きくする必要があります。
マイクロインジェクターに接続された針ホルダーに吸引針を挿入し、針ホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付けます。MBS充填注入トレイまたは皿に早期から中期の胃ステージ胚を入れます。動物の棒の近くの胚表面の下に針を挿入します。
解剖顕微鏡を通して針と胚を観察しながらマイクロインジェクターの充填ボタンを押します。数秒にわたって、針の透明な液体のレベルが上昇し、胚が崩壊して凹状になる。注入ボタンを1回以上パルスして、破片やプロテアーゼを含む針に入る曇った白質を排出します。
免疫ブロット上の切断産物を検出するために、抗体に応じて10〜20個以上の胚のブラスト胞液を吸引する。注入皿に置かれるパラフィン片に核を含まない水の1マイクロリットルをピペット。水滴に針を沈め、注入ボタンを押してブラスト胞液を水に払拭します。
あるいは、流体を直接パラフィルムに排出し、平坦化を防ぐために、注入ボタンをパルスして、より低い圧力で流体を排出する。採取したブラスト胞液を氷上の無菌マイクロ遠心分離管に移し、核を含まない水を加えて最終体積を30マイクロリットルに調整します。TGF-β前駆体タンパク質を検出するには、胚細胞を破壊した胚を氷上の別のチューブに移します。
過剰なMBSを取り除き、200マイクロリットルの冷蔵胚ライセートバッファーを加えます。胚を完全に均質化するために、塊が残らなくなるまで10〜20回上下のピペット。冷蔵マイクロ遠心分離機の均質化胚を10,000倍Gで10分間遠心分離し、P200ピペットを使用して上澄み物の160マイクロリットルを取り除き、氷上の新しいチューブに移し、チューブの下半分の白い黄身タンパク質やその他の細胞破片を避けるように注意してください。
マイクロ遠心分離を一度繰り返し、128マイクロリットルの清澄上清を氷上の新しいチューブに移します。この時点で、クリアされた胚のライセートおよび収集されたブラスト胞液は、所望の限りマイナス80°Cで保存することができる。メーカーの指示に従って、PNGase Fとトランスゴルジネットワークを介して修飾されたブラスト胞体流体中に存在する切断タンパク質を脱グリコシル化します。
脱糖剤は、SDSゲルのより凝縮されたバンドとして移行し、正確な同定に役立てることができます。ブラスト胞およびリセート中のプロドメインフラグメントモノマーおよび展開タンパク質を評価するには、4Xサンプルバッファーを15マイクロリットルのブラスト胞液および15マイクロリットルの明確な胚ライセートに加えて還元条件下でタンパク質を分析する。ブラストセレ内の切断ホモジメリックまたはヘテロ二量体リガンドの形成を評価するには、非還元4倍サンプルバッファーの5マイクロリットルを残りの15マイクロリットルのブラスト胞液に加えて非還元条件下でタンパク質を分析し、それを5分間加熱して氷の上に置きます。
このプロトコルを使用した後、タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫ブロットをmycエピトープタグを認識する抗体でプローブした。還元条件下では、Bmp4またはBmp7のみを発現する胚からのライセートにおいて、切断されたBmp4モノマーに対応する単一のバンドと、切断されたBmp7モノマーに対応する遅い遊覧バンドが検出された。両方のバンドは、Bmp4およびBmp7を共同発現する胚で検出された。
タンパク質が非還元条件下で分離されると、Bmp7タンパク質レベルが高い場合には、単一の成熟したBmp4および7ヘテロダイマーバンドの中間移動性が、胚のBmp4ホモジマーの微量と共に検出された。しかし、この場合、過剰なBmp7は、Bmp4とBmp7とを共発現させたホモダイマーおよび胚を形成した。
これらの結果は、ゼノプス・ラエビス胚で共発現した場合、Bmp4および7がヘテロ二量体を優先的に形成することを示した。この実験では、純粋なブラストセレを収集することは、正確な針の取り扱い経験を必要とする最も重要なステップです。だから、エラーを試してみて、修正し続けてください。
この手順は、BMPヘテロ二量体が形成されるかどうか、また、どのアミノ酸がこれに重要であるかをテストします。次のステップでは、これらのアミノ酸が哺乳類の発達中に機能的に重要であるかどうかを尋ねるために、マウスをノックインが生成することができる。
