この方法は、複雑なサンプルおよびバクテリオファージベースの診断および治療からバクテリオファージの列挙に関連するウイルス学および微生物学分野の主要な問題に答えるのに役立つ可能性がある。この技術の主な利点は、従来のアッセイでは実現不可能なファージディスプレイバイオパンニング実験から多数のサンプルを時間効率よく正確に定量化できる点にあります。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるラシュミ・モハンティとジャスミン・リールです。
プライマーを設計し、ストック濃度を作成した後、マイクロリットル当たり0.1マイクログラムの濃度でT7ファージDNAを参照してください。超純水を使用して、このDNAをマイクロリットル当たり100万フェムトグラムから0.2ミリリットルPCRチューブでマイクロリットル当たり1個のフェムトグラムまで10倍に連続して希釈します。各濃度の20マイクロリットルを調製し、希釈の各段階の間にピペットチップと渦管を変更することを確認します。
次に、T7ファージ参照DNA濃度をマイクロリットル当たりのフェムトグラムからマイクロリットル当たりのゲノムコピーに変換します。まず、サンプルT7ファージクローンのピペット200マイクロリットルを、10個の所望のサンプルのそれぞれについて1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れます。各チューブに2マイクロリットルのDNaseを1つずつ加えます。
チューブをキャップし、加熱された乾燥した浴で10分間摂氏37度でインキュベートします。その後、加熱された乾燥した浴で15分間摂氏100度でインキュベートします。熱処理ファージを含むチューブを18、534回gで10秒間遠心分離する。
遠心チューブをタッチアクティベーションモードで10秒間設定した渦ミキサーに置き、ファージを混合します。18、534回gで10秒間再びスピンします。この後、試料を室温まで冷却するために、約1時間実験室ベンチに置いておきます。
未知の濃度の10のバイオパンニングファージサンプルと三重濃度の標準濃度の7つのサンプルのためのqPCRプレミックスを準備しなさい。255マイクロリットルのqPCRマスターミックス、プライマー51マイクロリットル、水102マイクロリットルを含む51サンプルのプレミックスを得た。調製したPCRのアリコート8マイクロリットルは、96ウェルqPCRプレートの51ウェルに混合します。
次に、これらのウェルのそれぞれに熱処理T7ファージサンプルの2マイクロリットルを追加し、qPCRプレミックスの表面の下に分配します。粘着フィルムを使用して、プレートを密封します。蛍光光の漂白を最小限に抑えるために、アルミニウム箔でプレートを包み、次にqPCR装置上でプレートを実行するに進みます。
テキストプロトコルで説明されているように、サイクリング条件とメルトカーブの設定を設定します。qPCR を実行すると、増幅プロット、メルトカーブプロット、およびマルチコンポーネントプロットが生データから分析されます。増幅プロットは、各サンプルのPCR増幅が成功したかどうかを示します。
多成分プロットは、増幅サイクル全体にわたって蛍光シグナルの増幅と減衰を表します。メルトカーブプロットはプライマーの特異性を検証するために使用されますが、各PCR製品には1つのユニークな溶融温度があるためです。標準曲線は、次いで参照DNAから生成されます。
ここで、増幅効率は、qPCR研究から92.4%代表データと計算され、その後、1マイクロリットル当たり1000万~1000万ゲノムコピーの試験範囲で二重層プラークアッセイによって定量されたのと同じファージと比較される。ここで見られるように、qPCR定量中のファージの数は、プラークアッセイよりも高い。分散係数で表されるqPCR法の再現性は、この手順を試みる間、2.85~27.2%の範囲の値を有すると見られるが、試料の慎重な処理や調製、関連機器の較正など、qPCRの開発と使用に多くの考慮事項があることを覚えておくことが重要である。
この方法に従って、生体内バイオパニング、ファージライブラリーDNA調製および次世代シーケンシングおよびファージ検出に含まれる様々な用途においてファージ粒子を複雑な環境試料に列挙するために他の技術を行うことができる。ファージは実験室で生物学的危険と見なされ、手袋やラボコートを含む個人的な保護具などの予防措置は、手順を実行しながら常に着用する必要があることを忘れないでください。
