この方法は、蛍光発生プローブを用いてオルガノイドとしてインビトロで培養した生きた初代細胞における細胞ROSレベルを評価するための細胞生物学の分野において貴重なツールである。この技術の主な利点は、顕微鏡検査によって無傷の腸内オルガノイドにおいてROSを定性的に可視化し、96ウェルプレートを用いたフローサイトメトリーによって解離細胞において定量的に分析できることである。この方法は、他のオルガノイドモデルに適用することができ、代替蛍光センサを使用して、異なる細胞経路を解析することができる。
このプロトコルを初めて適用する前に、実験者はオルガノイドの培養と継代に精通している必要があります。私たちのプロトコルはスクリーニングアプローチによく適応していますが、初心者はいくつかのサンプルから始めるべきです。手順を実演するのは、研究室のエンジニアであるSophie Dulauroyです。
生後8~10週のLgr5-GFPマウスを犠牲にした後、十二指腸と回腸の間の空腸包接領域を5~8センチ採取し、抗生物質を添加した冷たいDPBSに氷上に置きます。次に、抗生物質を含む5〜10ミリリットルの冷たいDPBSで洗い流すことによって腸内容物をきれいにする。次に、ボールチップハサミを使用して、腸を縦方向に開き、鉗子を使用して、抗生物質を含む冷たいDPBSを含むペトリ皿に組織を移す。
皿の中のティッシュを振ってすすいでください。次に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して吸引して腸をつかみ、10ミリリットルの冷たい10ミリモルEDTAを含む15ミリリットルのチューブに移します。チューブを3回反転させ、氷上で10分間インキュベートする。
インキュベーション後、10ミリリットルのDPBSおよび渦を含むチューブに組織を2分間移す。直ちに10マイクロリットルの画分をペトリ皿に加え、顕微鏡を使用して画分の品質を評価する。DPBS含有チューブで2回の移送を行った後、各移送の間に2分間ボルテックスをかけ、以前に実証したように、EDTA中で腸を氷上で5分間インキュベートする。
DPBSを含むチューブで3回連続して移送した後、各移送の間に3分間のボルテックス処理を行い、選択したチューブを3回反転させ、70ミクロンのセルストレーナーでフィルタリングすることにより、最良の画分を50ミリリットルのチューブに結合します。その後、陰窩を回転させ、上清を捨て、ペレットを機械的に破壊してから、5ミリリットルの冷たいDMEM F12を加える。顕微鏡下で10マイクロリットルのアリコートに存在する陰窩の数を手動で数えます。
カウント後、再びクリプトを回転させ、上清を慎重に取り除きます。次いで、ペレットを機械的に破砕し、増殖培地をチューブに加え、マイクロリットル当たり90クリプトの濃度を得た。次に、希釈されていない基底膜マトリックスまたはBMMを2倍量加えて、マイクロリットルあたり30クリプトの最終濃度を得、混合物に気泡を導入せずに懸濁液を上下に慎重にピペットします。
フローサイトメトリー分析のために、プレート10マイクロリットルの陰窩BMMは、予め加温された丸底96ウェルプレートの各ウェルの中央にドームとして混合する。そしてイメージングのために、予め加温されたマイクロスライド8ウェルチャンバーに10マイクロリットルの混合物を薄層として堆積させる。BMMを室温で5分間固化させた後、プレートを摂氏37度および二酸化炭素5%のインキュベーターに入れる。
15分後、BMMが剥離しないように注意しながら、各ウェルに250マイクロリットルの成長培地を加え、プレートをインキュベーターに入れた。共焦点顕微鏡によって酸化ストレスを視覚化するために、オルガノイドで播種されたマイクロスライド8ウェルチャンバーの対応するウェルに1マイクロリットルのn-アセチルシステインストック溶液を加える。1時間のインキュベーションの後、対応するウェルに1マイクロリットルのtert-ブチルヒドロペルオキシド原液を加え、さらに30分間インキュベートする。
次に、ウェル当たり1.25ミリモル希釈の蛍光発生プローブを1マイクロリットル加え、続いて1ミリリットル当たり1.25ミリグラムのヘキスト溶液を1マイクロリットル加える。さらに30分間のインキュベーションの後、BMMを乱すことなく培地を除去し、フェノールレッドを含まない250マイクロリットルの温かいDMEMを静かに加える。蛍光発生プローブを検出する熱チャンバーとガス供給を備えた共焦点顕微鏡を用いてオルガノイドを画像化する。
ポジティブコントロールを使用して、ROS信号のレーザー強度と時間露出を設定し、この信号がネガティブコントロールで低くなっていることを確認します。次に、接眼レンズを用いて、スライドをスクリーニングしてGFPを発現するオルガノイドを同定し、レーザー強度を調整する。25マイクロメートルのzスタックをセットアップし、位置を定義してオルガノイド全体のステッチ画像を取得し、細胞の1層を示すオルガノイドのセクションを取得します。
オルガノイドを含む96ウェル丸底プレートの陰性対照ウェルに1マイクロリットルのnアセチルシステインストック溶液を加える。1時間のインキュベーションの後、対応するウェルに1マイクロリットルのtert-ブチルヒドロペルオキシド原液を加え、30分間インキュベートする。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、取り付けられたBMMを乱すことなく培地を取り出し、別の96ウェル丸底プレートに移します。
このプレートは脇に置いておきます。次に、100マイクロリットルのトリプシンを添加し、マルチチャンネルピペットを使用して、ピペットを5回上下させてBMMを破壊する。短い5分間のインキュベーションの後、2回目に上下にピペッティングすることによってオルガノイドを解離させる。
プレートを回転させ、プレートを反転させて上澄みを捨てる。別の96ウェルプレートに以前に集めた培地を対応するウェルに戻し、上下に5回ピペッティングして細胞を再懸濁する。次に、1マイクロリットルの蛍光発生プローブを添加し、30分間インキュベートする。
その後、プレートを再び回転させ、細胞を250マイクロリットルのDAPI溶液で再懸濁する。サンプルをフローサイトメトリーチューブに移し、チューブを氷上に保持します。モノステインされたサンプルを使用して、各蛍光色素分子の染色されていないコントロールおよびレーザー電圧の順方向散乱電圧および側方散乱電圧設定を最適化します。
次に、適切なゲーティング戦略を使用して、少なくとも 20,000 個のイベントを収集します。ROS染色およびオルガノイドの代表的な共焦点画像は、NAC阻害剤の存在下では、オルガノイドの内腔に含まれる死細胞からのシグナルのみが見えることを示した。非処理オルガノイドでは、特にGFP陽性細胞において基礎ROSレベルが見られ、幹細胞が分化細胞よりも高いROSを産生することを証明している。
GFP陽性細胞は、蛍光発生プローブの存在下でインデューサーと共により有意な細胞質シグナルを提示し、特に治療後の幹細胞においてROSレベルが増加することを実証している。腸内オルガノイドにおけるROS産生のフローサイトメトリー分析は、インヒビターによる刺激後に基礎ROSレベルが低下し、インデューサーによるチャレンジ後に増加することを示している。インヒビターで前処理し、次いでインデューサーで刺激された細胞は、インデューサー単独で刺激されたものよりも低いレベルが存在する。
GFP陽性としてゲーティングされた幹細胞に関する同様の解析では、阻害剤処理時にROSレベルが3.5倍低下し、非刺激細胞に対してインデューサー処理時に4倍の増加が示されています。この手順を試みるとき、ユーザーはオルガノイドの操作と解離の間に細胞ストレスを制限することを忘れないでください。さらに、ROSを分析する際には、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを常に含める必要があります。
この手順に続いて、固定されたインタクトなオルガノイドに対する免疫蛍光染色、細胞選別、および遺伝子発現解析によって解析を補完し、ROS調節に関するさらなる洞察を得ることができます。このビデオを見た後、マウスの腸内オルガノイドを成長させる方法、無傷のオルガノイドのライブイメージング分析を実行する方法、およびフローサイトメトリー分析のために腸内器官を処理する方法を知っている必要があります。
