当社のプロトコルは、セネダマイセスベネズエラ細胞フリー転写翻訳の簡略化されたワークフローを提供します。私たちのシステムは、この非モデル生物からの代謝酵素および経路を利用する。主な利点は、高いGC含有量を有する遺伝子の異種発現、良好なタンパク質転送環境の提供、生合成経路の微調整のためのオープンシステムである。
私たちの方法は、ストレプトマイセスと関連する高GC細菌の研究に新たな機会を開きます。これは、これらの細菌の酵素や遺伝子発現を研究することができます。この手法は、新しいユーザーによる実装を容易にするために開発されました。
経験や慣れ親しんだ経験を必要とする唯一のステップは、高度に活性な粗抽出物を生成する超音波処理です。3日目に前培養細胞の収穫を開始するには、600ナノメートルで光学密度またはOD測定のために新鮮なGYN培地で1対10の割合で一晩培養を希釈する。600ナノメートルの培養のODが0.3未満の場合、揺れ速度を毎分250〜300回転に上げ、ODが0.3に達するまで成長する。
さらに2時間以上成長しません。ODが0.3より大きい場合は、培養物を遠心分離容器に移し、湿った氷の上で30分間急速に冷却します。細胞培養が冷めるのを待っている間に、新鮮な1モルジチオトレイトール、S30AおよびS30Bバッファーの4ミリリットルを調製し、氷の上に保ちます。
空の50ミリリットル遠心管の重量を量った後、マイナス20度で予冷してください。氷の上のS30Aバッファーの1リットルに1モルジチオソトレイトールの2ミリリットルを追加し、よく混ぜます.6,000倍Gで細胞を摂氏4度で10分間遠心分離する。
素早い動きで上清を捨てた後、S30Aバッファーの250ミリリットルを加え、細胞の塊が均一に分散するまで遠心ボトルを激しく振って細胞を再懸濁する。その後、再び6分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨ててS30Aバッファーの添加を繰り返し、続いて、示されるように遠心分離を行う。
次に、氷上のS30Bバッファーの1リットルに1モルDTTの2ミリリットルを加え、よく混ぜます。細胞に250ミリリットルのS30Bバッファーを加え、遠心分離を繰り返します。細胞ペレットをS30Bバッファーの10ミリリットルに再懸濁し、細胞懸濁液をあらかじめ計量した50ミリリットル遠心管に移します。
必要に応じて、S30Bバッファーの追加5〜10ミリリットルで残留細胞を移し、S30Bで50ミリリットルの体積にチューブを充填します。細胞を10分間遠心分離します。上清を破棄し、前の設定で遠心分離を繰り返します。
上清を捨て、残りのS30B上清を100~200マイクロリットルピペットで吸引し、湿細胞ペレットを秤量する。1グラムの湿潤細胞ごとに、0.9ミリリットルのS30Bバッファーを加えます。パスツールピペットまたは渦を使用して細胞を再中断します。
遠心分離機は細胞を沈下するために約10秒間500Gまで短時間で沈下する。超音波処理器の先端をセルサスペンションに下げ、先端が液体表面から約1センチメートル下に置きます。超音波処理器の設定で異なるパラメータを入力します。
周波数を20キロヘルツ、振幅を65%パルスオン/オフ時間を10秒に設定し、合計超音波処理時間を1分に設定します。超音波処理を開始し、細胞が均等に超音波処理されていることを確認するために、最初の2つの休息サイクル中にチューブを上下に動かします。細胞が完全にlysedされていない場合は、チューブを2〜3回反転させ、細胞が完全に破壊されるまで頻繁に混合して追加の1〜2回の10秒サイクルの超音波処理を繰り返します。
細胞の破片を除去するために細胞を遠心分離し、その上清を1ミリリットルのアリコートとして1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。細胞抽出物の流出反応の場合、セル抽出物を含む細胞を30°Cで60分間、またはシェーカーなしでインキュベーターでインキュベーターでインキュベートします。転写翻訳反応のために、細胞抽出液SMMまたはMES溶液を解凍し、プラスミドDNAを氷上にします。
マイナス20度で384ウェルプレートを予冷します。体積の25%がプラスミドDNA、33.33%が細胞抽出物、41.67%がSMM溶液である氷上に転写翻訳反応を設定します。低速度設定で約5秒間、混合物を穏やかに渦巻き、発泡または泡の形成を避けながら溶液が均質であることを確認する。
気泡を導入することなく、技術的な三重として384ウェルプレートの3つの井戸に10マイクロリットルの3つのアリコートを移します。透明なカバーでプレートを密封した後、5秒間Gの400倍のプレートを回転させ、インキュベーターまたはプレートリーダーで28°Cで反応を振らずにインキュベートします。ストレプトマイセスベネズエラの無細胞転写変換は、pTU1-A-SP44標準プラスミドからの蛍光タンパク質の高収率発現と、ゲル電気泳動によって検出された生合成酵素に最適化されました。
pTU1-A-SP44-mScarlet-I標準プラスミドの発現は、いくつかの方法を用いて測定した。dBroccoli RNAアプタマーを用いたmRNAのリアルタイム蛍光測定では、FlAsHタグシステムを用いた未熟なmScarlet-Iタンパク質、および成熟したmScarlet-Iタンパク質を実施した。FlAsHタグを用いたmScarlet-Iのインゲル蛍光染色は、全無細胞タンパク質のクマシーブルー染色に加えて行った。
この手順に従って、活性アッセイは、標準的な方法を使用して困難である酵素および経路を研究するために行うことができる。また、スケールアップされた生合成と高スループットの遺伝子発現に向けても拡張されています。高GC菌の代謝酵素を研究する技術を開発しています。
私たちは、無細胞反応でスケールアップされた生合成を研究するシステムの可能性を示しました。
