ADHおよびFADは、異なる励起波長および発光波長で自己蛍光を示す内因性分子である。代謝反応の補酵素としての使用のために、自己蛍光顕微鏡は細胞代謝を評価することができる。NADHおよびFADの自己蛍光イメージングは、外因性標識を必要とせず、細胞内分解能を有する非破壊的方法である。
自己蛍光顕微鏡は、生きたサンプルや時間経過研究に使用できます。自己蛍光イメージングは、任意の生細胞または組織に広く適用することができる。自己蛍光イメージングは、ニューロン、癌細胞、腫瘍、インビボ、幹細胞、および免疫細胞に使用されてきました。
この手順を実証するのは、テキサスA&M大学の定量光学イメージング研究所の大学院生であるLinghao Huです。レーザー光源と検出器を含む多光子蛍光寿命顕微鏡のすべてのコンポーネントをオンにして実験を開始します。サンプルを配置する前に、明視野ランプをオンにし、光が接眼レンズに入ることを確認します。
次に、細胞イメージングの目的を選択します。対気目標を使用しない場合は、対物レンズの上に適切な浸漬媒体を 1 滴ずつ塗ります。ガラス底の皿を顕微鏡ステージ上のサンプルホルダーの上に置きます。
次に、X/Yステージコントロールを使用して試料を対物レンズで中央に配置し、試料が固定され、イメージング中に動かないことを確認します。完了したら、接眼レンズを覗き込み、目標を上に動かしてセルに焦点を合わせます。顕微鏡が囲い内にある場合は、ライトボックスのドアを閉じます。
次に、画像取得ソフトウェアを開き、[多光子イメージング]タブをクリックして、原稿に記載されているように多光子イメージングパラメータを設定します。検出器のゲインを蛍光寿命イメージング(FILM)に最適な値に調整します。次に、試料の各ピクセルにおけるレーザー支出の滞留時間を所望の値に変更する。
ニコチンアミドアデニンリン酸ジヌクレオチド、またはNADPHの場合、多光子レーザーを750ナノメートルに設定します。次に、レーザーのシャッターを開けたときにセルが損傷しないように、レーザーのパワー制御がゼロに設定されていることを確認します。発光フィルターを400~500ナノメートルに設定します。
パラメータを設定したら、フォーカスまたはライブビュー方式でイメージングを開始し、画像設定を最適化します。レーザー出力を3ミリワットから8ミリワットにゆっくりと上げながら、セルにピントが合っていることを確認します。調整が完了したら、最大使用電力を記録します。
記録された最大電力設定は、ペトリ皿の他のセグメントのイメージングに使用します。画像積分時間が60秒のNADPH-FILM画像を収集し、蛍光寿命減衰曲線内の細胞質画素に対して100光子のピークなど、画像に十分な数の光子があることを確認します。光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の時間を長くします。
フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)イメージングでは、多光子レーザーを890ナノメートルに設定し、レーザーが新しい波長でモードロックするのを待ちます。レーザーのパワーコントロールが最初にゼロに設定されていることを確認します。発光フィルターを500~600ナノメートルに設定します。
画像設定を最適化するには、レーザー出力を 5 ~ 10 ミリワットに増やし、最大使用電力を記録して、フォーカスまたはライブビュー方式でイメージングを開始します。後続の視野のFADイメージングに同じ電源設定を使用します。画像積分時間60秒のFAD-FILM画像を収集し、蛍光寿命減衰曲線内に十分な光子があることを確認します。
光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の継続時間を長くし、各画像を2つの視野に離して、さらに4〜5視野(FOV)でイメージングを繰り返します。80ミリモルのシアン化ナトリウム溶液を作るには、130.24ミリグラムのシアン化ナトリウムを25ミリリットルのPBSに溶解する。培養皿から、100マイクロリットルのシアン化ナトリウム溶液で置換する培養液100マイクロリットルを吸引し、ディッシュ中のシアン化物を4ミリモル濃度で得た。
細胞をインキュベーターに5分間入れて、細胞がシアン化物溶液と反応できるようにします。シアン化物曝露後、前述のように細胞のNADPHおよびFAD画像を取得する。この研究では、尿素から測定された機器応答関数(IRF)を使用して蛍光寿命パラメータを計算しました。
パラメータを、セグメンテーションに用いた各細胞の細胞質のピクセルにわたって平均化した。個々の細胞を同定し、バックグラウンドノイズを除去するためにマスクした。その後、核を同定し、細胞マスク上に投影した。
さらに、細胞を濾過して、典型的な細胞のサイズに適合しないマスクされた領域を除去した。NADPHおよびFADの多光子蛍光寿命イメージングにより、シアン化物処理前後の細胞形態および代謝の可視化が可能となった。NADPHの寿命はシアン化物処理で短くなるのに対し、FADの寿命はシアン化物処理後に長くなることが観察された。
代表的な箱ひげ図は、MCF7細胞の光学酸化還元比がシアン化物処理後に減少したことを示した。シアン化物曝露は、MCF7細胞の振幅加重NADPH寿命を減少させた。短寿命および長期寿命はNADPHでは減少したが、NADPHアルファ1については増加した。
FADの場合、MCF7細胞の振幅加重寿命はシアン化物曝露後に増加した。短寿命と長寿命の両方がFADでは増加しましたが、FADアルファ1では減少しました。サンプルに十分なレーザー出力を持たせることが重要ですが、出力が多すぎると細胞に損傷を与える可能性があることに注意してください。
自己蛍光イメージングは細胞に損傷を与えないため、その後の生化学的アッセイを同じサンプルで使用することができます。
