הפרוטוקול מספק דרך פשוטה ללמוד ג'וקים אמריקאים. מזיק תברואתי נפוץ וחרק מועיל לרפואה הסינית המסורתית. זה יעזור לחקור את המנגנונים המולקולריים של פעילויות חיים מרובות של מקקים אמריקאים על ידי הפלת גנים ספציפיים.
היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא יכולה להפיל גנים בג'וק אמריקאי או חרקים דומים אחרים שאינם מתאימים לעריכת גנים. טכנולוגיה זו יכולה לשמש כדי לחקור תחומים שונים כגון רגולציה גנטית ואפיגנטית, תהליך פיתוח של רקמות, התחדשות של נספחים, התנהגות הזדווגות, וצדדים מעניינים אחרים של הג'וק האמריקאי. טכנולוגיה זו קלה לתפעול ורב-תכליתית.
אנו מציעים לשמור על בעלי החיים בריאים במהלך טיפול הזרקת DSRA. אני מאמין טירונים יכולים בקלות לשלוט בטכניקה זו לאחר מספר מפגשי תרגול. כדי להתחיל, להפריד את הנימפות בקעו מן oothecae עם מסננת צמצם ארבעה מילימטר.
בחר את P.americana לבן טרי מאלט עם צינור זכוכית. מניחים את P.americana במיכלים חדשים ולחכות לשלב הנכון לטיפול. במערכת התגובה, להוסיף 10 מיקרוליטרים של מאגר T7 2X, 2 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים T7 Express ושני מיקרוגרם של מוצר PCR.
לבסוף, לפצות את הנפח הכולל ל 20 microliters עם מים מזוקקים כפול. מערבבים בעדינות הפוך באופן ידני ודגרים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לדלל 4 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר RNase פתרון עם מים DEPC ביחס של 1 עד 200.
לאחר מכן הוסיפו 1 מיקרוליטר של יחידה אחת לכל מיקרוליטר RQ1 RNase חינם DNAse ו 1 מיקרוליטר של פתרון RNase A מדולל למערכת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף 10% מהנפח הכולל של אצטט נתרן ושלושה כרכים של הנפח הכולל של איזופרופנול.
מערבבים בעדינות הפוך באופן ידני, ואז מניחים על קרח במשך חמש דקות וצנטריפוגה ב 13, 000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם פיפטה. לאחר מכן, לשטוף את השאריות עם 75% אתנול, עם 25 אחוז מים שטופלו DEPC, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 13, 000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
הסר supernatant שוב, אוויר לייבש את הכדור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להמיס את הרנ"א התקוע הכפול עם כ -100 מיקרוליטרים של מי DEPC ולדלל אותו לריכוז הסופי של 2 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר. הגדר את התוכנית במשאבת microinjection כדי להבטיח כי הנפח של כל זריקה הוא עקבי.
לאחר מכן לנקות את המזרק על ידי מילוי אותו עם מים DEPC 8 עד 10 פעמים. התקן את מזרק 10 מיקרוליטר על משאבת הזרקת מיקרו. לאחר מכן להפעיל את המשאבה ולמלא את המזרק עם 10 microliters של פתרון RNA תקוע כפול.
מרדימים את המקקים עם פחמן דו חמצני, ואז מרימים אותם בעדינות עם פינצטה ומעבירים את הג'וק לכיוון המחט ביד. לאחר מכן, הכנס את המחט דרך הפער בין שתי חבטות בטן אופקית נגד האפידרמיס. הזרקו את תמיסת הרנ"א התקועה הכפולה לתוך הג'וק והבטיחו שקצה המחט קרוב ככל האפשר לאפידרמיס כדי למנוע פגיעה באיברים פנימיים.
לבסוף, לשלוף את קצה המחט. שים את המקקים המוזרקים לתוך מיכלי bioassay נקיים. המתן כ 10 עד 20 דקות כדי לאפשר להם להתאושש מההשפעות של פחמן דו חמצני.
לסמן את המיכלים עם תאריך הזרקה, סוג ומינון של RNA תקוע כפול וגיל של P.americana. Ddc או DOPA decarboxylase ו Dpp או גנים decapentaplegic נבחרו כשתי דוגמאות כדי לבחון את הפנוטיפ של מקקים מאלט לאחר הזרקת RNA תקוע כפול dsMocK אשר אין מטרה בבעלי החיים נלקחה כמו שליטה שלילית. יעילות RNAi זוהתה על-ידי qRT PCR.
הגנים הופלו באופן משמעותי עם ערך P של פחות מ 0.01 עבור dsDdc ופחות מ 0.05 עבור dsDpp. P.americana עם גנים Ddc נוקאאוט היה האפידרמיס הלבן בשל מלניזציה חסומה. בניסוי עם זריקות dsDpp, RNAi שיבש התחדשות הגפיים.
החרקים צריכים להיות בריאים ומוזרקים ללא נזק. טכנולוגיה זו מספקת דרך פשוטה לחקור פונקציות גנים עבור חרקים שלא ניתן לערוך גנים כגון מקק אמריקאי.
