Le protocole fournit un moyen simple d’étudier les cafards américains. Un ravageur sanitaire commun et un insecte bénéfique pour la médecine traditionnelle chinoise. Il aidera à explorer les mécanismes moléculaires de multiples activités de vie des cafards américains en détruisant des gènes spécifiques.
Le principal avantage de cette technologie est qu’elle peut détruire des gènes chez les cafards américains ou d’autres insectes similaires qui ne conviennent pas à l’édition de gènes. Cette technologie peut être utilisée pour explorer divers domaines tels que la régulation génétique et épigénétique, le processus de développement des tissus, la régénération des appendices, le comportement d’accouplement et d’autres aspects intéressants du cafard américain. Cette technologie est facile à utiliser et polyvalente.
Nous suggérons de garder les animaux en bonne santé pendant le traitement par injection de DSRA. Je crois que les novices peuvent facilement maîtriser cette technique après plusieurs séances d’entraînement. Pour commencer, séparez les nymphes hachées des oothèques avec un tamis à ouverture de quatre millimètres.
Choisissez le P.americana blanc fraîchement malté avec un tube en verre. Placez le P.americana dans de nouveaux récipients et attendez le bon stade pour le traitement. Dans le système de réaction, ajoutez 10 microlitres de tampon T7 2X, 2 microlitres du mélange d’enzymes T7 Express et deux microgrammes de produit PCR.
Enfin, augmentez le volume total à 20 microlitres avec de l’eau double distillée. Mélanger doucement à l’envers manuellement et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Diluer 4 microgrammes par microlitre de solution de RNase A avec de l’eau DEPC dans un rapport de 1 à 200.
Ajoutez ensuite 1 microlitre d’une unité par microlitre RQ1 RNase Free Dnase et 1 microlitre de solution diluée de RNase A au système. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 10% du volume total d’acétate de sodium et trois volumes du volume total d’isopropanol.
Mélanger doucement à l’envers manuellement, puis placer sur de la glace pendant cinq minutes et centrifuger à 13 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez le résidu avec de l’éthanol à 75%, avec de l’eau traitée à 25% de DEPC, puis centrifugez à 13 000 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.
Retirez à nouveau le surnageant, séchez la pastille à l’air libre pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, dissoudre l’ARN double brin avec environ 100 microlitres d’eau DEPC et le diluer à la concentration finale de 2 microgrammes par microlitre. Configurez le programme dans la pompe à micro-injection pour vous assurer que le volume de chaque injection est constant.
Nettoyez ensuite la seringue en la remplissant d’eau DEPC 8 à 10 fois. Installez la seringue de 10 microlitres sur la micro-pompe d’injection. Ensuite, démarrez la pompe et remplissez la seringue avec 10 microlitres de solution d’ARN double brin.
Anesthésiez les cafards avec du dioxyde de carbone, puis ramassez-les doucement avec une pince à épiler et livrez le cafard vers l’aiguille à la main. Ensuite, insérez l’aiguille via l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme. Injectez la solution d’ARN double brin dans le cafard en veillant à ce que la pointe de l’aiguille soit aussi proche que possible de l’épiderme pour éviter d’endommager les organes internes.
Enfin, retirez la pointe de l’aiguille. Mettez les cafards injectés dans des récipients d’essai biologique propres. Attendez environ 10 à 20 minutes pour les laisser se remettre des effets du dioxyde de carbone.
Étiqueter les récipients avec la date d’injection, le type et la dose d’ARN double brin et l’âge du P.americana. Ddc ou DOPA décarboxylase et Dpp ou gènes décapentaplégiques ont été sélectionnés comme deux exemples pour observer le phénotype des cafards maltés après injection d’ARN double brin et dsMocK qui n’a pas de cible chez les animaux a été pris comme un témoin négatif. L’efficacité de l’ARNi a été détectée par qRT PCR.
Les gènes ont été significativement détruits avec une valeur P inférieure à 0,01 pour dsDdc et inférieure à 0,05 pour dsDpp. P.americana avec les gènes Ddc knockdown avait l’épiderme blanc en raison de la mélanisation bloquée. Dans l’expérience avec des injections de dsDpp, l’ARNi a perturbé la régénération des membres.
Les insectes doivent être en bonne santé et injectés sans dommage. Cette technologie fournit un moyen simple d’explorer les fonctions des gènes pour les insectes qui ne peuvent pas être modifiés par des gènes tels que le cafard américain.
