この方法は、微生物叢のメンバー、特にヘリコバクター属のメンバーが炎症および癌に及ぼす影響に関する消化器内科分野の重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ヘリコバクター感染の研究と生理学的条件下での胃への影響を可能にすることです。この技術の影響は、ヘリコバクター感染の予防または排除、または抗生物質、薬物、またはワクチンを含むその結果のための治療法の開発にまで及ぶ。
これらの方法は、ヘリコバクター感染の病因に特異的な洞察を提供する。しかし、いくつかの技術は、他の胃腸病原体の研究に適応され得る。一般的に、この方法に新しい個人は、マウスに感染を確立することができる細菌接種の調製に苦労するだろう。
ヘリコバクター分離株は、インビトロで広範なサブカルチャーを受けていないマウスコロニー形成株として知られていることが不可欠です。さらに、これらの株のためのインビトロサブ培養の数を記録する必要があります。15ミリリットルポリスチレンチューブに細菌懸濁液を加え、プラスチックループを使用して、各培養液滴から個々のガラス顕微鏡スライドに10〜20マイクロリットルの液滴を移します。
次に、100倍の倍率で位相対視下で細菌の生存率と運動性を評価する。細菌の大部分が細菌の形状を有する場合にのみ、H.pyloriイノクラを使用してください。H.フェリスイノクラは、主にヘリカル型細菌を含むべきである。
そして、イノクラを個々の使い捨て、1ミリリットルの注射器にロードします。各注射器に23ゲージの針を装備し、プラスチックパラフィンフィルムを使用して、各針に使い捨てのポリエチレンカテーテルを取り付けます。次に、6〜8週齢の特異的病原体フリーマウスとヘリコバクターフリーマウスを首と尾の擦り傷で手動で拘束し、1つのカテーテルを開いた顎の中心に挿入する。
カテーテルを口蓋に向かって導き、マウスの首を伸ばして食道を通して胃にアクセスしやすくし、カテーテルのほとんどまたはすべてが見えなくなり、抵抗が感じられるまで気管から離れる。次いで、最適なコロニー形成および疾患病態を確保するために、少なくとも1回10回を第5の細菌に送達する。実験の最後に、細かい湾曲したはさみを使用して腹腔を開き、胃の切除を行います。
大きな湾曲に沿って胃を切断し、任意の残留食品を除去するために、洗浄ごとに新鮮なPBSの1つの50ミリリットルチューブでオルガンを2回静かに洗います。2回目の洗浄の後、組織をタール、6センチメートル、プラスチックペトリ皿に入れ、濡れた重量を記録します。胃を平らにした後、試料を角栓、身体、および非腺前胃領域を含む2つの等しい組織断片に射手的に二分する。
非腺領域を取り除き、計画下流分析のために適切な溶液に組織片を貯蔵する前に、各胃の半分を計量する。10%ホルマリンを含む15ミリリットルの円錐管に胃組織の残りの半分を加え、10秒後に組織をチューブの上面に平らにします。組織がチューブ壁に貼り付けられたら、サンプルをホルマリンに少なくとも24時間浸し直します。
胃内の生存可能なH.pyloriの数を数えるために、BHIに保存された胃試料を均質化し、生じた胃均質物の重複した連続希釈を新鮮な無菌のスープで行う。乾燥した馬の血液寒天、またはHBAを3つまたは4つのセグメントに追加の抗生物質を添加したプレートを分割し、マイルとミスラ技術の適応を使用して、各寒天プレートのセグメントに各胃ホモゲネート希釈液の10〜100マイクロリットルを追加します。ホモジナイートを無菌のプラスチックループで広げ、プレートを乾燥させます。
次に、水のペトリ皿とガスパックを含む嫌気性ガス瓶の逆の位置にプレートを置きます。その後、瓶を摂氏37度で4~7日間インキュベートします。コロニーが観察される場合は、10〜100個の孤立したコロニーを含むセグメントを列挙する。
安楽死後、胃は動物から収穫され、体重を量る。非腺領域は除去され、胃はアントルムと体を含む2つの等しい半分に分けられる。正常なコロニー形成は、典型的には、HBAプレートに縞状胃均質から個々のコロニーの生存可能なカウントおよびその後の列挙を行うことによって確認される。
なお、マウス胃微生物叢や多数のH.pyloriコロニーからの汚染細菌の存在は、H.pylori CFUsの列挙を複雑にする可能性があることに注意してください。あるいは、PCRを用いて、H.felisおよびH.pylori ureB遺伝子の325塩基対領域に向けられた特異的検証済みプライマーを使用して感染を検証することができる。この代表的な実験では、野生型C57 Black-6マウスは、H.フェリスへの感染後6ヶ月間の過形成および腺萎縮、ならびに粘膜下膜の細胞浸潤を含む中程度の炎症徴候を示した。
ノックアウトマウスでは同時に重篤な炎症が認められ、リンパ系卵胞が細胞浸潤に近接して観察される。H.フェリス菌は、感染したマウスの胃組織のギームサ染色切片でも可視化することができる。この手順に従って、定量PCR、免疫体化学、または免疫蛍光などの他の方法を実行して、ヘリコバクター感染中に誘発される宿主応答の種類に関する追加の質問に答えることができる。
その開発後、この技術は、微生物学と消化器内科の分野の研究者がヒトの胃疾患におけるヘリコバクター・ピロリの原因的役割を探求する道を開いた。このビデオを見た後、ヘリコバクター種のマウスに再現的に感染する方法と、感染に関連する病理を研究する方法をよく理解する必要があります。このプロトコルで使用されるヘリコバクター株は感染性であるため、これらの細菌を使用している間は常に標準的な生体安全手順に従う必要があることを忘れないでください。
